insertion dans un phage

[invite481f0dd7]

salut
durant mes révisions j ai lu que lorsqu'on insère un fragment d' ADN etranger dans un phage il n'y a qu'une chance sur 6 d'obtenir ce qu'on désire
il y a 2 possiblités à cause des 2 sens possibles d'orientation de l'ADN etranger (la je suis d accord)
mais aussi 3 possiblités pour le cadre de lecture
mais si on insère ladn normalement il n a qu 'un endroit possible pour se fixer par complémentarité non?
vu qu'il ne peut se fixer que sur la séquence qui correspond parfaitement.
je comprends pas trop
merci de m 'expliquer
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[invitec9f0f895]

Salut,

Bon il manque pas mal d'infos mais je pense que tu parles de la technique de phage display qui permet de cribler des peptides grace a une librairie de phage.
Alors pour les 6 possibilites.
En effet le fragment d'ADNpeut se cloner dans les deux sens, et ensuite il peut se trouver dans n'importe laquelle des trois phases de lecture. Donc en effet ca fait 6 possibilites:
. mais qu'est-ce que ca veut dire?

Ce qu'il ne faut pas perdre de vue est que tu cherches a faire une protéine de fusion il est donc obligatoire que le fragment d'ADN que tu clones soit dans la bonne pahse de lecture par rapport au gene de la protéin auquel tu le fusionnes.
Comme cet ADN est obtenue par des cassures aléatoires, il peut etre cassé a n'importe quelle positions.

Un petit exemple:
La séquence suivante (ADNg).
ATGCCGTACGAAGTGGCTAAAACAGCAATA GCTAGCAGTCGCCGCCTG

cassons cet ADN (une cassure par molécule): (symbolisé par ^)
ATGCCGTAC^GA^AGTGG^CTAAAACAGCA ATAGCTAGCAGTCGCCGCCTG
on a donc une solution qui contiendra notamment les fragments suivants:

1. GAAGTGGCTAAAACAGCAATAGCTAGCAGT CGCCGCCTG
2. AGTGGCTAAAACAGCAATAGCTAGCAGTCG CCGCCTG
3. CTAAAACAGCAATAGCTAGCAGTCGCCGCC TG
Ces fragmenst sont fusionnés a un gene de la maniere suivante:

Le gene:
ATG-NNN-NNN-NNN-(le fragment)-TAA
Tu vois bien que si la bonne pahse de lecture (qui est la premiere) n'est pas en phase avec le gene alors la protéine ne s'exprimera pas.

Selon les trois phase tu obtiendras les protéines suivantes (en aa), la lecture debute au codon ATG du gene du phage:

1. EVAKTAIASSRRL
2. SG*NSNS*QSPP (les * representent des codons stop)
3. LKQQ*LAVAA

Tu vois bien que selon la phase de lecture les polypeptides obtenus sont totalement differents, seul le 1 t'interesse a priori.


Yoyo

[invite481f0dd7]

merci beaucoup
en effet c est plus clair comme ca...