protocole immuno-histo-chimique

[invite89dd0a72]

Bonjour à tous!

Je réalise un protocole immuno-histo-chimique
mais je suis totalement novice dans ce type de manip.
C'est pourquoi j'ai besoin de votre aide:
j'aimerais comprendre tout ce qu'il se passe (de manière globale)
sur mon tissus pendant toutes les étapes de mon protocole:
> fixation: acétone-méthanol
> inhibition des peroxydases endogènes: H2O2 + PBS/Tween
> blocage des sites non spécifiques: anti-rabbit Ig
> anticorps primaire: Ac Ki67 + solvant
> anticorps secondaire: Ac II ImmPress reagent anti-rabbit Ig
> révélation à la DAB
> contre coloration à l’HEMATOXYLINE DE MAYER
> carbonnate de lithium
> déshydratation dans 2 bains d'alcool et 2 de toluène
> montage des lames

Est ce que quelqu'un peut m'aider???
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[Flyingbike]

Je ne suis pas un pro des immuno mais voila mes connaissances :

> fixation: acétone-méthanol

Permet de stabiliser le tissu

> inhibition des peroxydases endogènes: H2O2 + PBS/Tween

permet de neutrealiser les peroxydases en vue de la coloration au DAB (qui est oxydé par les peroxydases en un produit coloré)

> blocage des sites non spécifiques: anti-rabbit Ig

permet de supprimer les interactions protéine-protéine non spécifiques en les "occupant", ici avec des IgG non spécifiques de lapin

> anticorps primaire: Ac Ki67 + solvant

permet la fixation spécifique d'un anticorps (de lapin) sur la protéine Ki67 (marqueur de prolifération)

> anticorps secondaire: Ac II ImmPress reagent anti-rabbit Ig

permet la fixation d'un anticorps anti lapin sur l'anticorps anti-Ki67 (amplifie le signal)


> révélation à la DAB

c'est la révélation : ton anticorps secondaire est couplé a une peroxydase, qui transforme le DAB en un produit coloré, donc localisé la ou Ki67 se trouve (d'ou l'intéret d'inactiver les perox. qui trainent un peu partout)

> contre coloration à l’HEMATOXYLINE DE MAYER

permet de colorer les noyaux

> carbonnate de lithium

?

> déshydratation dans 2 bains d'alcool et 2 de toluène

j'imagine que ton protocole n'est pas dans l'ordre ici, normalemen tu déshydrates ton tissu pour le couper, puis tu le réhydrates pour l'immuno...

[invite89dd0a72]

Merci beaucoup pour ta rapidité!!
Mais sinon c'est quoi des péroxydases endogènes?

[piwi]

Le protocole n'est pas dans le desordre. C'est simplement que le montage en "dur" (eukitt) se fait dans un solvant type toluen, histosol ou histolemon.

Pour le carbonate de lithium je crois qu'il renforce la coloration nucléaire de l'hématoxyline.

piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Pour les peroxydases endogènes, ce sont les peroxydases qui sont présentent dans ton tissu avant que tu n'ajoutes ton anticorps couplé à la peroxydase. Ces peroxydases endogènes utiliseraient la DAB exactement comme ton système de révelation et génereraient du bruit de fond.

[Flyingbike]

oui je comprends bien mais il faut bien deshydrater au début pour faire les coupes (sauf si autre chose que de la paraffine), sinon pour le montage oui je comprends tout a fait.

Les peroxydases sont des enzymes qui détoxifient des dérivés nocifs de l'oxygène, tu comprends bien que quand tu utilises une peroxydase pour mettre en évidence une protéine, il faut supprimer les endogènes pour ne pas parasiter ta coloration.