Western blot

[inviteb9fe40fa]

Bonjour à tous,
Je cherche le moyen d'optimiser le transfert(en western blot) des protéines de haut poids moléculaire.
Auriez-vous des pistes à me donner?
Merci.
Nsemen.
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[Flyingbike]

quelle taille ?

Ce qui peut influencer le transfert :
le temps
l'intensité/tension
le type de membrane (PVDF, nitrocellulose...)
le type de transfert (immergé, semi-sec)

mais je ne sais pas si cela dépend de la taille des protéines...

[Moumoutte]

Bonjour,

oui effectivement je pense que tu peux jouer sur le temps et tenter un transfert sur toute une nuit. Les grosses protéines transfèrent mal.
Sinon tu peux également essayer d'augmenter le voltage. (cependant tu risques peut être de faire sortir les petites.... à toi de voir).
Qu'utilises-tu comme protocole?

Cordialement

[inviteb9fe40fa]

La protéine fait 289 KDa
J’utilise un protocole assez classique, à savoir :
-Transfert immergé
-Tampon transfert : 100mL de tampon commercial (bio rad)
200mL éthanol
800mL d’eau distillée
200 volts, 250mA pendant deux heures en glace
Sur membrane de nitrocellulose.
pensez vous que la nature de la membrane puisse influencer l'efficacité de transfert?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Moumoutte]

Bonjour,

effectivement c'est une grosse protéine.

Le premier conseil que j'aurai est donc de faire un transfert sur la nuit (à 4°C à 30V par exemple).
Je ne pense pas que la nature de la membrane joue énormément, cependant le PVDF fixe mieux les protéines.
Un facteur qui peut également jouer est la balance éthanol/SDS. Le SDS aide tes protéines à sortir du gel mais diminue leur fixation à la membrane; à l'inverse l'éthanol aide à la fixation mais empêche les protéines de sortir du gel. Tu peux donc essayer peut être d'augmenter la quantité de SDS et de baisser un peu l'éthanol. Le plus difficile étant de trouver le bon équilibre.

Cordialement

[LXR]

Lorsque je travaillais sur BRCA1 (230 kDa), un transfert qui marchait bien après migration sur polyacrylamide 6% avec stacking (4%) :

- Tampon de transfert classique (Tris, Glycine, sans SDS)
- Ethanol 15% final
- Ampérage constant 350 mA minimum 1h30, 2 h vont très bien

Cependant une personne de mon équipe a réalisé un transfert d'une très grosse protéine (>300 kDa) et il a un tampon de transfert adapté, pris d'une publie. Il réalise son transfert à 20V à 4°C et a noté une nette amélioration du transfert des marqueurs de haut poids moléculaire comparé aux méthodes classiques.

Greg

[inviteb9fe40fa]

Merci à tous pour vos conseils.
Pourrais-tu me communiquer(si tu les as) les réf de la publication.
Encore merci

[invite807a92f5]

Bonjour,
très intéressante cette discussion. Effectivement, est-ce qu'il serait possible d'avoir la référence de la publication sur l'utilisation du tampon de transfert pour les grosses protéines?
Merci d'avance