Co-IP : protéines qui se coat sur les billes :(

[mantOs]

Salut à tous

Voilà en ce moment je suis en train de faire des Co-IP in vitro pour montrer l'interaction (si c'est le cas) entre 2 protéines purifiées.

Problème mon contrôle (négatif) sans anticorps pour IP est positif.
J'ai testé en utilisant un anticorps qui n'avait rien à voir à mes protéines et rebelotte!

En gros mes protéines se collent à mes billes magnétiques... au vu de la protéine que j'étudie c'est pas étonnant vu qu'elle à la fâcheuse tendance à s'agréger et à faire l'inverse de ce qu'on voudrait!

Auriez vous un remède à ça? Je ne peux pas changer de protéine pour IP et je voudrais éviter de prendre des billes agarose car ma protéine d intérêt culotte toute seule.

J'ai pensé pour le prochain test saturer mes billes avec du PBS BSA après les avoir lavées?

Si vous avez d'autres astuces profitez en !

Merci d'avance

Cordialement

m
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[LXR]

Salut,

La saturation des billes avec de la BSA est la première chose à laquelle j'ai pensé. A voir si d'autres sont aussi d'accord avec cette solution.

Greg

[piwi]

Oui c'est bien la chose à tenter. Cependant, ce n'est pas la panacée et ça ne solutionnera peut être pas le problème. Le problème m'est déjà arrivé et malgré toutes les saturations et les lavages ma protéine se collait toujours sur les billes.
Ce que je n'ai pas tenté à l'époque, c'est de modifier la salinité (NaCl 500mM, 1000mM), pour voir si je parviens à décrocher les liaisons aspécifiques.

Cordialement,
piwi

[invite94cdbdf6]

Bonjour !
Je pense être confronté à un phénomène un peu similaire.

J'effectue une co-IP du même type sur une protéine membranaire.
J'avais au départ un très fort bruit de fond, que j'ai cherché à solutionner avec un pré-lavage avec mes billes, que j'élémine avant de mettre mon AC primaire et de suivre un protocole classique.

Si celà m'a permis de diminuer grandement le bruit de fond, ca m'a aussi fait perdre fortement mon signal à tel point que je ne vois plus certains interactants !!

Je soupconne être confronté à une forte interaction spécifique qui diminue grandement ma quantité de protéine et je pense que je vais essayer de saturer les billes.

Je dois avoir que je n'avais pas fait le contrôle négatif dont tout est partie pour l'auteur du post et je vais le faire des ma prochaine IP, et je pense qu'il sera aussi positif que si j'avais mis mon AC :grrrr

Saturer avec du lait marche aussi? Combien de temps et à combien de %??

Merci !!

[A voir en vidéo sur Futura]