efficacité acceptable qPCR ?

[invitec3be7f0b]

Bonjour tout le monde,

je viens de tester l'efficacité de plusieurs couples d'amorces pour réaliser des PCR quantitatives (en SYBR green). Le problème est que, quels que soient les couples, j'obtiens une efficacité entre 70 et 75 %, pas moyen de passer au-dessus :/

J'ai lu quelque part qu'une efficacité trop basse (< 90 %) était un problème car amenant à trop peu de reproductibilité. Pourtant, j'ai beau répéter et répéter la manip, mon efficacité est hyper stable ! Donc j'en déduis, pas de pb de reproductibilité.
Y a-t-il une autre raison pour laquelle une efficacité de 75 % ne serait pas acceptable ? Si oui, une idée ?...

Merci !
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[gorben]

Salut,

Si tu t'attends a des differences d'expression entre tes genes d'un facteur 10 ou plus, une efficacite de 70% est ok. Si tu attends 2x difference il faut que tu travailles les conditions PCR. As tu essaye de changer de mastermix? MgCl2? Tm? Ton efficacite est basse a cause de dimere de primer?

A+

[invitec3be7f0b]

Merci de ta réponse.
Malheureusement, ce serait plutôt de l'ordre du 2x...
J'utilise un master mix "Power SYBR Green" d'applied biosystems, dans la doc ils ne parlent pas de modifier la concentration en MgCl2, donc je ne sais pas si c'est faisable.

Les Tm des amorces sont bons a priori, entre 58 et 60.

En revanche, je ne savais pas que des dimères d'amorces pouvaient diminuer l'efficacité (mais ça paraît logique). Néanmoins, je n'ai rien dans mon contrôle "no template" (master mix + amorces + eau), donc je suppose que je n'ai pas de dimères d'amorces.

[gorben]

Bizarrement chez moi les dimeres apparaissent souvent en presence de template. Tu devrais essayer de deposer la totalite de tes produits qPCR sur gel pour voir ce que tu obtiens.
Pareil, j'ai souvent eu des problemes avec certains mastermix. J'utilisais le meme que toi et j'avais des dimeres et une mauvaise efficacite. Apres avoir telephonne a la compagnie le tech m'a dit d'essayer differente marque de mastermix . Je suis passe chez qiagen et c'est nickel

Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec3be7f0b]

??!! ça me paraît hallucinant ce que t'a répondu Applied... c'est pas motivant

Bon, sinon j'ai une vague idée pour tenter d'améliorer mon efficacité. Je vais la mettre en oeuvre demain après-midi ; quant à la dépose sur gel, je ne vois rien à 40-50 nt (taille supposée d'un dimère d'amorces ?...), mais j'ai en RT- une bande à 72-78 qui est spécifique de ma manip (ancre de PCR, blablabla). Je me demande si ce n'est pas cette ancre qui fait tout foirer, cela dit on ne la voit pas sur les puits effectivement amplifiés ?...

Bref, je ne suis pas au bout de mes peines, ni des trucs à essayer
Je vais donc tenter de m'occuper du cas de cette ancre, et si ça ne marche toujours pas, je suivrai ton conseil et commanderai un "trial kit" chez qiagen.

Encore merci de ton aide !