PCR: a quoi servent les differents elements

[invitec81608cd]

je souhaiterais savoir à quoi servent les differents ingredients dans la solution pour la PCR

les dNTP
les amorces
le MgCl2
le solution tampon
la Taq polymerase
le DMSO si besoin est

merci pour vos commentaires
céline
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[invite4ff9937a]

Salut

Les dNTP sont les bases ATCG qui vont servirent a polymériser le brin d'ADN suivant le brin matrice.
Cette polymérizaton s'effectue par l'enzyme, la Taq polymerase.
Cette enzyme requière pour son bon fonctionnement le tampon et le MgCL2.

Enfin les amorces servent a amplifier un fragment d'ADN spécifique dû a la complémentarité de l'amorce sur une région de la matrice et sert à l'enzyme pour démarrer son activité de polymérization. Sans amorce l'enzyme ne sait pas démarrer une polymérization.

Le DMSO ???? Jamais utilisé de DMSO dans mon mix moi!

cordialement

[Guillaume69]

Bonjour,

*dNTP, amorces, taq polymérase, c'est pour la réaction de polymérisation. cf. ce lien : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/pri...esentation.htm
*Le tampon, c'est pour le bon fonctionnement de l'enzyme : il lui faut un pH particulier qui ne doit pas évoluer au court de la réaction. Or, les dNTP et l'ADN n'ont certainement pas les mêmes propriétés acidobasiques ; d'où l'utilisation du tampon.
*Le MgCl2, je pense que c'est pour jouer sur la stringence d'hybridation (fixation des amorces).
*Le DMSO empêche la formation de structures tertiaires (appariement de Hoogsteen par exemple) qui pourraient gêner la réaction.

[invite75e918c6]

La Polymérase Chain Reaction est utiliser dans la duplication de l'ARN ou ARN d'un endroit spécifique ou tout le brin,
Donc tu as besoin de nucléotides complémentaire à la séquence exploité (dNTP)

Les amorces, bah ils vont se fixer à une séquence que tu souhaite et vont permettre de servir de point de départ pour qu'une ADN/ARN polymérase face son boulot.

Justement, ta Taq Polymérase va se servir des dNTP et des amorces pour polymérisé de façon complémentaire et anit-parallèle, la séquence où commence l'amorce

Les brins d'ADN et surtout ceux d'ARN sont très fragile, d'où l'utilisation de solution tampon pour éviter tout changement de pH pouvant ainsi casser la molécule ainsi pour avoir un pH qui sera optimum à l'action de la Taq Polymérase

Et le MgCL2... euh, bon n'écoute pas ce que je dis car je ne suis pas sur mais je sais que cette molécule est utilisé pour les extractions, pour enlever les dernières molécules d'eau qui traine dans le solvant

Le DMSO a plusieurs fonction mais je pense que dans ce cas, il agit comme un solvant et un cryoprotecteur si tu congèle ton ADN/ARN


Voilà à peu près ce que je sais de mon coté ;-D

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je vais trancher : pour le MgCl2, c'est un cation divalent nécessaire à l'activité de nombreuses enzymes dont la Taq, mais il peut aussi jouer en tant que sel dans la température d'hybridation. Pour le DMSO c'est en effet pour éviter les structures II dans l'ADN.

[invite58df182d]

Au plus simple, le MgCl2 est un cofacteur de la Taq Polymérase pour son bon fonctionnement.

[piwi]

Vous êtes bien gentils d'avoir répondu à cette liste de courses.
La moindre des choses avant de poser une question c'est d'essayer de trouver les réponses par soit même.
A la limite je veux bien comprendre pour le MgCl₂. Mais demander à quoi servent les dNTP, les amorces et la Taq, faut peut être pas exagérer. C'est vraiment manquer de respect aux gens.

Cordialement,
piwi

[kamor]

Le MgCl2 se lit aux dNTP, seul ce couple est reconnu par la Polymerase. De plus, il favorise les liaisons ADN-ADN, donc favorise l'appariement des amorces

[invitec81608cd]

je vous remercie beaucoup pour vos réponses
cela me sera très utile
encore merci à tous

[kamor]

Enfin comme l'a dit piwi, un simple coup d'oeil même sur wikipedia vous aurait appris le role de la polymerase, des dNTP et des amorces.
Je sais pas où vous en êtes dans votre cursus, mais plus on progresse, plus on passe son temps à chercher des infos à droite à gauche. Si je devais demander aux autres tout ce que je cherche à longueur de journée, je passerai mon temps à attendre

[lorino]

Bonjour à tous,
J'ai une question concernant la PCR alors hop je la glisse dans ce topic.
La PCR est utilisée pour détecter la présence de bactéries par exemple dans un aliment. On introduit des amorces pour amplifier un gène donné. D'après ce que j'ai compris, ce sont les amorces qui permettent de sélectionner un gène donné, c'est bien ça ?
Quant à la détection, comment se réalise-t-elle?
On introduit des éléments fluorescents, mais quelqu'un peut-il m'expliquer comment se passe la détection ? merci beaucoup

[kamor]

Bonjour, en fait ce qu'on cherche c'est une séquence génique spécifique de l'espèce donné ou du genre, c'est comme on veut. Après que ce soit un gène ou pas, c'est secondaire.

La spécificité se fait sur 2 éléments, la complémentarité des amorces sur la séquence d'ADN, donc on aligne quelques centaines de séquences de différentes espèces pouvant être dans notre milieu et on choisit deux sites spécifiques de notre espèce d'intérêt.
Ensuite il y a la taille de l'amplicon, c'est à dire en gros l'écart entre nos deux amorces sur le brin d'ADN. Là c'est statistique, une amorce c'est 20 bases en gros qui doivent être d'une séquence donnée. Sur un génome, vous avez le risque que vos amorces aillent se fixer ailleurs, c'est rare mais bon. Par contre que vos deux amorces aillent s'hybrider en gardant le même "écartement" c'est hautement improbable.

La détection. Soit on introduit des fluorophores directement pendant l'amplification, qui n'émettent de la fluo que dans un double brin, et on mesure la fluo quand les amplicons sont créés et en double brin (PCR Temps Réel), soit on fait un gel d'électrophorèse , donc on fait évoluer l'ADN dans une matrice poreuse grâce à un courant électrique puis on met les fluorophores et on mesure la fluo. On aura ainsi la visualisation des amplicons et on pourra voir leur taille. (PCR Classique)
Dans le type de PCR que je décris, on a aussi le moyen de déterminer la taille de l'amplicon, on chauffe progressivement la solution, une molécule d'ADN double brin se séparera à une température donnée (le Tm) suivant sa longueur. QUand la molécule s'ouvre, les fluorophores n'émettent plus de lumière.

Il existe d'autres techniques, je présente les plus simples
Bon e

[mantOs]

Les amorces correspondent à des séquences du gène que tu veux amplifier.

Pour ce que tu nous raconte, il s'agit de PCR quantitatives où grosso modo il y a incorporation d'un element fluo pendant l'élongation (pour un type de qPCR donné) la détection s'effectue grace à un lazer qui va quantifier l'intensité de fluo qui augmente avec la quantité d'ADN.

Sinon tu peux faire des PCR classiques où la détection se fait sur Gel d'agarose/acryl(suivant les fragments) en utilisant des intercalants.

Edit : Owned.

[lorino]

merci de votre réponse.
J'ai compris la première partie, mais pour la détection pas vraiment.
En gros, ça emet de la fluorescence que quand c'est en double brin, et quand le double brin se sépare la fluorescence diminue, du coup on suit le nombre de cycles (?)

Dans le cas où on cherche une séquence exacte (on ajoute une séquence connue pour détecter telle bactérie) je ne vois pas pourquoi utiliser le gel de migration ...
Dernière question, on détecte une séquence spécifique, donc une certaine bactérie, mais ca ne veut pas dire que ce gene s'exprime .... comment faire?

[kamor]

Non, désolé j'ai un peu précipité cette partie, je le reconnais
En fait on étudie la spécificité de l'amplification, déterminé par la taille de l'amplicon pour les raisons que j'ai expliquées, par une étape située après la PCR en elle même, comme lors d'une PCR normale. On part d'une température "basse" genre 50°C et on l'augmente progressivement jusqu'à 95°C où tous les brins d'ADN seront séparés. Et le principe est celui que vous décrivez. l'avantage est que c'est directement après, sans que l'on fasse aucune manipulation, plus un gros gain de temps

Le gel de migration est pour le même principe de spécificité. On peut simplement mesurer la fluorescence, mais comment être sur que tous les acides nucléiques qui réagissent sont spécifiques de notre réaction? On les fait migrer et on regarde leur taille.

Pour regarder si un gène s'exprime, c'est simple, on regarde s'il y a des ARNm (donc dans ce cas ce doit être un gène), en gros on les extrait, on les rétrotranscrit (on forme l'ADN complémentaire grâce aux enzymes de virus et on fait une PCR) ou on cherche la protéine correspondante pour être vraiment sur qu'il y a traduction
Si vous voulez plus d'infos, j'ai retrouvé ce site en anglais http://www.pcrstation.com/learn-about-pcr/ et sur la droite vous avez les différents types de PCR, regardez Real Time PCR et RT PCR

[lorino]

Merci pour vos réponses. Les profs ont dit que j'avais très bien exposé les choses et c'est en partie grâce aux précisions que vous m'avez apportées.
Merci encore.