PCR qui veut pas marcher

[SoulPower]

Bonjour, je suis actuellement en stage dans un labo de recherche. Mon objectif est de mettre en place un protocole de PCR pour faire du typage bactérien. Pour sa, je dois amplifier des microsatellites spécifiques de cette bactérie. En 1er je dois déterminer la dilution limite à laquelle on ne peut plus observer d'amplification sur gel (les dilutions sont du 1/10 au 1/10 000). Mon problème c'est que j'arrive quasiment jamais à amplifier de l'ADN. Un coup sa veut bien et le lendemain sa ne marche plus. Je demande donc votre aide pour bien vouloir m'éclairer sur mon problème.

Comment faire un bon mix PCR?
Comment faire pour ne pas avoir des problèmes de pipettage?
C'est quoi le secret d'une PCR réussi?
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[Flyingbike]

avant toute chose relative a la manip, il faut etre sur d'avoir des amorces bien spécifiques de ce que tu veux amplifier.
Ensuite il faut un ADN bien dosé et bien homogène (comme tous les réactifs). quel est ton protocole ?

[SoulPower]

Pour les amorces, je suis sur qu'elles sont spécifique. Elles sont été prise dans une publication.
Justement je sais pas si sa vient du fait que je prépare mal mon mix. Pour un même répété x fois, j'ai pas toujours de l'ADN amplifié.
L'ADN que j'utilise, n'est pas dosé. Je sais juste qu'il y a de l'ADN dedans vu que j'ai quelque amplification par ci par la.
Pour le protocole, je pense que c'est un protocole classique: eau, tampon, MgCl2, dNTP, couples d'amorces et GoTaq. Le tout pour un volume de 25µl. Je fais en tout 35 cycles au thermocycleur et l'identification se fait sur un gel d'agarose à 1% avec du GelRed.

Je tiens à préciser que c'est le 1er stage que je fais sur de la PCR.

[kamor]

Et il faut avoir une concentration d'amorces et des temps ainsi que des températures qui permettent aux différentes étapes de se dérouler sans problème.
PS = c'est ça, et non sa

[A voir en vidéo sur Futura]

[SoulPower]

Tous les couples d'amorces sont à 5µM. Le temps pour les cycles sont 10min à 94°C, 30sec à 94°C, 60sec à 59°C, 60sec à 72°C et 10min à 72°C. Je sais que le cycle marche puisque parfois ça a marché mais quand je mets tout ensemble au thermocycleur dans des tubes séparés pour chaque amorce sa marche plus. Je pense que sa peut surement venir au moment où je fais mon mix. La façon dont je le prépare. On me dit que la Taq, c'est fragile. Mais je fais comment pour prendre correctement la bonne concentration dans le tube si je l'agite pas un peu. Est ce que c'est déconseiller de vortex le mix avec la Taq dedans avant de mettre le tout au thermocycleur?

Merci, je crois que après je vais faire un stage de français

[kamor]

La Taq était considérée comme fragile, on a un peu réduit ces problèmes en les trafiquant et en les protégeant.
10 min à 94°C ? C'est beaucoup je trouve pour une étape d'activation.
Par contre, si j'ai bien compris, si tu mets tous tes couples d'amorces ensemble, tu as tes primers, par contre un par un ça ne fonctionne pas. Donc si c'est bien ça, es tu sur de bien apparier tes couples d'amorces

[piwi]

10 min à 94°C ? C'est beaucoup je trouve pour une étape d'activation.

Non, c'est assez classique. Il faut bien lyser les bactéries. En tout cas, c'est pas ça qui va flinguer la Taq

[SoulPower]

Ce que je veux dire c'est que j'ai 3 couples d'amorce par exemple. Donc je prépare 3 mix PCR et sur ces 3 mix, je vais avoir qu'un seul des trois mix où je vais avoir de l'ADN qui va s'amplifier et sur les autres rien. C'est que je comprend pas, je dois bien faire une erreur quelque par mais où, c'est la quel est la question mystère.
La quantité de Taq prélevé par mix est tellement faible que à chaque fois je vérifie bien si j'ai quelque chose dans mon cône, parce que sa c'est un coup à ne rien prendre et donc ne rien amplifié.

[Edelweiss68]

Bonsoir,

En gros, si tu as quand même une amplification spécifique dans l'un de tes trois tubes et que ce sont les mêmes réactifs que tu utilises pour les trois couples d'amorces, sachant que j'imagine que tu ne manipules pas différemment pour les différents couples d'amorces: cela doit sûrement venir de la spécificité des couples d'amorces!

Les trois couples sont tirés de la littérature?

PS:
- moi aussi je faisais 10min à 95°C 20°C/s au début et pas de soucis
- par contre, la Taq, j'évitais de la vortexer et j'homogénéisais par aspiration/refoulement tout doucement

[kamor]

Non, c'est assez classique. Il faut bien lyser les bactéries. En tout cas, c'est pas ça qui va flinguer la Taq

Ca va pas la flinguer, mais ça peut l'endommager. A moins que ce soit une Hot Start c'est vrai, j'avais oublié cette catégorie
Mais cette étape je la fais toujours avant pour une autre raison car la PCR peut être inhibé par les constituants cellulaires en trop grande quantité.
Je préfère donc lysé, puis diluer au 1/10ème pour faire ma PCR.

[invite23579454]

bonsoir

D'après ce que j'ai compris , lorsque vous lancez trois séries de réaction , ça ne marche pas. Peut être c'est la duré que vous mettez pour passer d'un mix à l'autre . c'est à dire que si vous mettez la Taq dans la première série de tube , le temps d'arriver aux derniers tube du troisième mix, la Taq pourra être dégradée dans les premiers tubes si vous ne travaillez pas dans les conditions convenables (bac de glace) vue la sensibilité de cette enzyme .
C'est juste une idée , c'est à vous de voir votre façon de manipuler

[Flyingbike]

si tu as 3 couples différents : est ce le meme qui marche pas a chaque fois ? avez vous essayé de baisser l'annealing (genre 57 ou 58) ? quelle est la taille prévue de l'amplicon ?

Pour les amorces, je suis sur qu'elles sont spécifique. Elles sont été prise dans une publication.

ouh, alors ça n'est pas un gage de spécificité, on a des surprises en blastant les amorces des fois...

[kamor]

D'accord avec Flyingbike. Sans parler des rectifications qui arrivent parfois, "désolé, on s'est trompé en recopiant la séquence".

[SoulPower]

Je pense que la publication est assez sérieuse, elle est répertorié dans pubmed.
Pour la préparation du mix je fais sa sur un portoir classique sans glace, juste sous une hôte pour éviter toute contamination de mes tubes et mes mix.
Peut être que la Taq se dégrade. C'est pour sa que maintenant je fais un mix pour tous mes tubes et ensuite j'ajoute les amorces et Taq.

Merci, de vos explications, je continue quand à chercher ce qui ne va pas et de remettre en cause ma façon de manipuler.

[Flyingbike]

Je pense que la publication est assez sérieuse, elle est répertorié dans pubmed.

encore une fois, c'est pas du tout une preuve de qualité, et je te conseille de vérifier systématiquement les amorces.

La taq est solide, je travaille actuellement avec un tube qui a passé une demi journée hors du congel, elle marche autant qu'une autre. A mon avis le problème est ailleurs...

[sacharybalka]

Juste une petite idee, les trois couples d'amorces ont la meme annealing temperature?

[piwi]

Pour la Taq il faut quand même rester pragmatique. Elle reste dans le termocycleur à des températures oscillant entre 55-60°c et 95°C durant 1h30 - 2h. C'est pas 10 pauvres minutes de plus ou de moins qui vont la faire s'effondrer ni même l'endommager. Par ailleurs il est intéressant de parler des HotStart. La question des HotStart n'est pas d'avoir des enzymes plus résistantes à la chaleur. En fait ce sont des Taq comme les autres à la différences près que le site catalytique est obstrué par un chaperon afin d'éviter des initiations parasites de polymérisation. "l'activation" de l'enzyme ne vise en fait qu'à retirer ce chaperon.

[SoulPower]

Je n'utilise pas de HotStart. La Taq utilisée d'autre assez classique, c'est une GoTaq. Je sais pas si c'est très fragile mais j'évite quand même de la laisser en dehors du bloc réfrigéré.
D'après la publication il n'y a que 2 couples d'amorce qui ont la même température d'hybridation à 59°C et l'autre elle serai à 58°C. Je pense que sa n'influence pas trop.
Je continue mes recherches et mes PCR.

[Flyingbike]

possible mais si tu hybrides trop chaud, tu n'auras rien. Tu devrais essayer a 57°. le temps d'amplification est bien adapté ?

La GoTaq (Promega) est hot start (comme une grosse partie des Taq classiques).

[SoulPower]

Après plusieurs PCR, je n'avais plus de produit pour mon mix et j'ai du donc en changer. J'ai changé le MgCl2, le dNTP et le tampon. J'ai du aussi utiliser un autre thermocycleur en gardant le même protocole. Apparemment les température d'hybridation n'était pas en cause. Miracle, ça s'est mis à fonctionner. Je ne sais pas lequel de ces paramètres à permis à ma PCR de marcher mais l'essentielle c'est que sa fonctionne.