Bonjour,
on vient de me présenter un western blot d'un genre nouveau, le blot en pointillés.
Les bandes aspécifiques sont normales mais la bande qui correspond à la prot d'intérêt (RPN2, 63kD) sort en gros pointillés. Je n'ai jamais vu ça et je sèche un peu pour aider mon étudiante sur ce coup. Tous ces autres blots sont nickels ce qui me fait éliminer pas mal d'hypothèses genre buffer, pb de transfert..
Si vous avez des suggestions, je suis preneuse.
BioCell
Salut,
N'aurait elle pas trop charge de son echantillon? Generalement quand je depose trop, mes bandes non spe sont normales et ma bande spe est en negatif (genre repulsion de l'Ac) et sort blanche sur fond noir...
Peut etre est ce le meme principe, mais dans un degre moindre.
a+
Bonsoir,
elle a normalement chargé 50µg de lysat (faut que je vérifie) et son actine sort bien.
Je vais essayer de mettre la main sur un scan, ca aidera peut etre à la réflexion.
Merci d'avoir répondu en tout cas.
Cela peut être un problème de transfert spécifique de ta protéine. C'est la première fois que ce blot est effectué dans ton labo?
Bonsoir,
oui c'est la première fois qu'on bosse dessus.
On a augmenté le voltage du transfert (30V au lieu de 22, transfert semi liquide) au cas où ca transferait pas bien mais le résultat n'a pas changé..
Certaines protéines sont capricieuses lors du transfert. Tu utilises du PVDF, tu transfères en méthanol sans SDS? Tu fais 30V combien de temps?
PVDF, méthanol sans SDS et le transfert "classique " chez nous c'est 22V, 30 min.
Je lui ai fait augmenter un peu le voltage mais je n'ai jamais fait de mise au point de transfert et je ne sais pas trop sur quel paramètre jouer en priorité.
Avant je faisais un transfert identique à toi au niveau chimique (PVDF, méthanol sans SDS), 1 heure 30 à 400mA constant. J'avais les protéines de haut poids moléculaire qui se transférait mal vu avec les marqueurs de taille + PARP non clivé (110 kDa). Du coup je suis passé au même transfert mais d'une durée de 2h15-2h30. Tout se transfère très bien, sans augmentation notable de la température (avantage du transfert sans SDS), et les protéines de bas poids moléculaire (20 kDa), se transfère aussi bien. Tu peux donc essayer d'allonger le temps de transfert, voire de faire un faible voltage sur la nuit à 4°C.
ok je vais essayer.
Pourtant avec notre méthode, je sors PARP et Notch1 clivé (130kD) sans pb. RPN2 est peut etre du genre capricieuse..
Donc si j'allonge le transfert, disons 1h30, je peux garder le meme voltage sans que ca chauffe trop?
Merci de ton aide.
Moi j'ai des blocs de glace adaptés que je met directement dans la cuve de transfert c'est très efficace. Lorsqu'il n'y a pas de SDS en principe ça ne chauffe pas avec ce système.
Pour PARP, en effet sur une autre lignée cellulaire où elle est bien exprimée, pas besoin d'optimiser le transfert. Mais j'ai une autre lignée où elle est peu exprimée et pour en transférer suffisamment pour qu'elle soit détectable, je dois déposer peu de protéines (20 µg) et transférer longtemps...
Ah zut, on n'a pas ça. Ca va être direction la chambre froide alors..
Avant d'avoir ces blocs de glace je disposais ma cuve de transfert dans un bac en polystyrène suffisamment grand (genre les emballages frais de Sigma) rempli de glace. En disposant la glace tout le tour de la cuve, ça évite que ça chauffe, mais c'est moins efficace que le bloc directement dans le tampon...
Je sais pas pas si la chaleur a un effet très grand sur tes protéines. En effet, celle-ci ont déjà parcourus le gel et donc sont déjà à la bonne place. Au pire la chaleur va dégrader l'épitope utilisé par ton anticorps.
De plus, nous réalisons toujours le transfert semi-sec à température ambiante pendant 2h et ça marche bien pour tous nos anticorps.
Blots en pointillés, tu as peut-être "cramé" ton signal, j'entends par là que le signal était tellement fort que tout le réactif de détection à été utilisé avant que tu puisse détecter. Donc le milieu de la bande est blanc (plus de réactif) et le contour est noir car il te reste du réactif.
Moi j'essayerais plutôt de diluer plus ton anticorps (c'est moins cher, plus spécifique). Mais j'y pense, as tu réaliser plusieurs dilutions afin de trouver la concentration optimale de cet anticorps ^^.
Ce serait plus facile d'interpréter avec un scan mais je ne crois pas tellement au problème de transfert, plutot un artefact avec l'anticorps comme Nicolas.
Bonsoir à tous,
merci pour vos conseils, la solution a été finalement trouvée... dans les data suplementaires d'un papier: faire un gel à 7,5% plutot que 10%. Pourquoi, je n'en sais rien mais si les auteurs ont trouvé le besoin de le mentionner c'est qu'ils ont du ramer aussi (on se rassure comme on peut).
BioCell
et ca a résolu le problème ?
Oui, probleme resolu aussi bizarre que ca puisse paraitre.
La technique du Western Blot est sans aucun doute la plus complexe que je connaisse. Bien souvent trop prise à la légère, c'est en ayant de sérieux problèmes qu'on appréhende toute sa complexité.
Le gel moins dense peut avoir un effet soit sur la migration, soit sur le transfert, ou les deux bien sûr (qui a dit que le transfert était à exclure des causes possibles du problème?). Les interactions de la protéine avec le polyacrylamide ne sont pas à exclure non plus.
Enfin, heureux que ton problème soit résolu!
