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Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?



  1. #1
    miss titcha

    Exclamation Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?


    ------

    Bonjour,

    Je travail dans un labo de R&D microbio qui vient juste d'ouvrir un secteur biologie moléculaire, on est donc en plein développement.
    J'aurais besoin de rendre des cellules E.coli compétentes pour faire une transformation de plasmide mais je n'ai dans mes stock que la souche ATCC Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers (n° 8739).
    Est-ce que quelqu'un à déjà essayer et réussit à les rendre compétentes (avec la méthode au CaCl2) ou faut-il que je commande une souche spéciale?
    Je retrouve souvent la souche DH5-Alpha dans les protocoles mais je ne l'ai jamais utilisée.
    J'aimerai éviter d'avoir à acheter des cellules déjà compétentes du style TOP10 pour des raisons économiques...!

    Merci d'avance!

    -----

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  3. #2
    Aqualung

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    La méthode du CaCl2 fonctionne très bien avec les DH5-alpha. Je n'ai jamais utilisé que cette souche, quelque soit le labo où j'allais. Elle fonctionne très bien également et n'étaient pas spécialement cher. Tu conserve un glycérol de cellules non compétente et tu en aura pour toute ta thèse-carrière normalement.

  4. #3
    miss titcha

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    ok, merci!

  5. #4
    piwi

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Les XL1-Blue sont aussi assez classiques.
    On utilise aussi souvent les BL21 quand on veut faire des inductions d'expression proteiques par l'IPTG (certaines protéases sont inhibées dans ces bactéries). Elles poussent pas mal.
    Il peut aussi être intéressant d'utiliser des bactéries dont les enzymes de méthylations ont été inactivées. Dans ce cas là, j'utilise les GM41.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  6. #5
    miss titcha

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Pour le coup, je cherche juste à identifier un plasmide de résistance donc j'ai juste besoin d'une souche qui transforme bien et qui soit high copy.
    C'est pour ça que j'espérais pouvoir travailler sur mes E.coli "basiques" et éviter d'acheter un tube de cellules à 400e...!
    J'hésite à faire un essai avant de commander des cellules étant donné qu'ATCC ne donne aucunes données à ce sujet.

    Mais merci

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Si vous n'avez que cela à faire, il vous faut simplement vous procurer soit des DH-5, soit des XL-1 Blue. Basta!

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  10. #7
    Yoyo

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    salut

    totalement d'accord avec Piwi

    YOyo

  11. #8
    miss titcha

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Finalement j'ai commandé des cellules DH5alpha compétentes en attendant de savoir si je ferais beaucoup de transfo ou pas. (pas moyen de trouver un peu de cellules dans un fond de congélateur et pas les moyens d'en acheter un tube...!)
    Merci à vous pour vos réponses

  12. #9
    piwi

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Pensez bien à faire pousser un peu de bactéries vides pour vous refaire un stock de compétantes (au CaCl2). Quite à dépenser un peu d'argent, autant ne pas avoir à le faire deux fois, même dans 10 ans

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    miss titcha

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Je ne risque pas de perdre la compétence en les faisant poussées puis recongelées?
    Si non effectivement, ça vaut le coup. Merci!

  14. #11
    piwi

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Il faut faire une mise en compétance au CaCl2.

    C'est tout bête mais il faut être un peu soigneux et bien travailler au froid.
    Vous amenez 100ml de bactérie à DO 0.4-0.5, vous mettez cela dans deux falcon 50 et vous laissez sur glace 10 min. Un tour de centri à froid pour culoter à 4000 rpm (faudrait pas que vos cellules pètent) et vous ajouter dans chacun des tubes 25ml de CaCl2 50 mM fraichement préparé. Vous remettez doucement en suspension et laissez sur glace 10 mins. Encore une centri. Pendant ce tempsVous préparez 4.3 ml de CaCl2 + 0.7 mf de glycérol.
    2.5 ml par tube, remise en suspension; vous aliquotez et congelez au -80°C ad vitam eternam.

    La compétance est à tester sur boite en transformant les bactéries avec une quantité donnée d'un plasmide temoin. En général, par cette méthode on a un résultat qui va de 105 à 5.106; ce qui est largement suffisant pour vos besoins.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  15. #12
    miss titcha

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    D'accord, en faite je fais comme si je travaillait à partir de cellules non compétentes.
    J'y avais pensé mais je n'arriviais pas à trouver de donnée sur l'efficacité de transfo qu'on obtenait après ça (j'avais peur de flinguer mes cellules en leur infligeant un 2eme traitement au CaCl2...). Mais la voilà!
    Merci beaucoup.

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  17. #13
    Pfhoryan

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Il faut faire une mise en compétance au CaCl2.
    Encore mieux, la préparation de cellules compétentes avec du chlorure de rubidium en plus (cellules au moins 10x plus compétentes qu'avec le CaCl2):

    Solutions stock:
    RF1
    12 g RbCl
    9.9 g MnCl2•4H2O
    30 g K Ac (potassium acetate)
    1.5 g CaCl2•2H2O
    150 g glycerol

    * ajuster le pH à 5.8, volume final de 1.0 L
    * filtrer à 0.22 micron, stocker à 4°C


    RF2
    20 mL 0.5 M MOPS (pH 6.8)
    1.2 g RbCl
    11 g CaCl2•2H2O
    150 g glycerol

    * ajuster le pH à 6.8, volume final de 1.0 L
    * filtrer à 0.22 micron, stocker à 4°C

    Méthode:

    Ensemencer à raison de 1 ml de préculture pour 100 ml de milieu LB.
    Faire pousser à 37°C jusqu'à une DO590 d'environ 0.4.
    Centrifuger les cellules à 2000 rpm durant 15 minutes à 4°C.
    Resuspendre avec un volume de RF1 glacé correspondant à 1/3 du volume de culture.
    Laisser 15 minutes sur la glace (DH1, DH5, JM101) ou 2 heures (HB101)
    Centrifuger les cellules à 2000 rpm durant 15 minutes à 4°C.
    Resuspendre avec un volume de RF2 glacé correspondant à 1/12.5 (0.08) du volume de culture.
    Incubation 15 minutes sur glace.
    Congeler sous forme d'aliquots de 500 µl dans l’azote liquide. Conserver jusqu'à 2 ans à -70°C.
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  18. #14
    piwi

    Re : Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

    Ca c'est cool! Je ne connaissais pas. Je note immédiatement le protocole.
    Merci beaucoup.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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