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Gène0 AOX1!!



  1. #1
    cysto

    Exclamation Gène0 AOX1!!

    Bonjour !!!
    Parmis les avantages de la production de protéines recombinantes chez Pichia pastoris, on cite souvent la présence d'un promoteur fort :AOX1 ...Comment peut on exploiter ce promoteur aprés l'avoir isolé de cette souche afin de produire des protéines recombinantes dans de grandes quantités ?
    MErci

    -----


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  3. #2
    Lopgor

    Re : Gène0 AOX1!!

    1) Enzyme de restriction spécifique à AOX1 ainsi qu'au plasmide vecteur de clonage. Donc découpage des deux au bon endroit.

    2) Insertion du promoteur dans le plasmide et reapariment de base car notre enzyme de restriction est spécifique et a couper notre fragment au bon endroit.

    3) Insertion du plasmide dans une bactérie

    4) Multiplication des plasmides contenant le promoteur AOX1 par mitose donc il faut les mettre dans un milieux qui leur convient avec beaucoup de nutriments.

    Toutefois je ne suis pas spécialiste et je serai ravis que qualquin complete et corrige mon raisonement.

    Sinon PCR peut très bien fonctioner aussi ?

  4. #3
    piwi

    Re : Gène0 AOX1!!

    Je n'ai pas bien saisi la question initiale mais en revanche j'ai vu ceci
    Multiplication des plasmides contenant le promoteur AOX1 par mitose
    Un plasmide qui se divise par mitose? Certainement pas; la mitose est un processus qui intéressent les cellules, pas leurs sous partie. Pensez donc, c'est comme si vous aviez écrit qu'un chromosome se divise par mitose; ça ne veut strictement rien dire. Un plasmide se réplique et puis voilà. Les bactéries se divisent pas scissiparité.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    Lopgor

    Re : Gène0 AOX1!!

    Merci pour cette correction.

    En effet je n'ai pas très bien compris les mécanismes qui menenet à la multiplication des "plasmides vecteur de clonage" qu'on insère dans une bactérie.

    Le plasmide est il présent dans la majorité des bactéries issue de la bactérie dans laquelle on a inséré le plasmide ?

    Dans quelles proportion ?

    Comment se multiplie le plasmide ? Trouve t'on 1 seul copie par bactérie ou peut on avoir plusieurs fois le même plasmide dans la même bactérie ?

    Merci

  6. #5
    piwi

    Re : Gène0 AOX1!!

    Le plasmide se trouve dans la bactérie et vit sa vie indépendamment de son hôte. En clair, il se réplique à son rythme. Le nombre de copies présentes dans la bactérie est variable selon les plasmides. Il existe des plasmides qui se répliquent beaucoup (des dizaines de copies par bactéries) et à l'opposé des plasmides qui se répliquent peu (une à quelques unités par bactéries). La distribution semble se faire de manière aléatoire. La bactérie se divise et chaque descendant emporte avec lui ce qu'il y avait dans son coin.

    En laboratoire, on utilise le plus souvent des plasmides high copy. Du coup, comme il y a beaucoup de plasmides par bactéries, toutes les descendantes ont le plasmide.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    cysto

    Re : Gène0 AOX1!!

    Merci pour vos réponses !!
    Pour répondre à Log, en complément à ce qu'a dit piwi, dans une bactérie ,on peut trouvé une centaine de plasmides ....et ce ne sont pas toutes les bactéries qui vont assimiler le vecteurs, pour les sélectionner ,il existe ce qu'on appelle le Criblage ...je peux m'étaler si tu veux ....
    Mais c'est pas ma question : je la repose autrement:

    Expliquer moi ce petit passage :
    L'expression du gène AOX1 ne se fait qu'en présence de méthanol et seulement celui ci , ainsi le gène AOX1 a été isolé, son promoteur a été introduit dans des vecteurs pour diriger l'expression du gène codant pour la protéine désirée .
    Merci

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  10. #7
    Lopgor

    Re : Gène0 AOX1!!

    Le passage je l'explique ainsi:

    Le promoteur a un opérateur sensible au méthanol.

    Lorsque méthanol est présent la proteine sera produite. Lorsque méthanol est abscent il n'y aura pas de proteine.

    L'opéraateur fonction donc par Inhibition.

    Lorsque méthanol est présent rien ne se produit.

    Lorsque méthanol est abscent les facteurs de transcription changent de configuration et bloquent l'opérateur du promoteur. La synthèse de la proteine n'a pas lieu. Car ARNpolymerase ne peut s'attacher au promoteur suite à la modification de configuration des proteines indispensable à l'initiation de la transcription.

    Sinon je veux bien connaitre tes techniques de séléction lors du criblage de banque. La seul que je conaisse est l'antibiotique :P

  11. #8
    cysto

    Re : Gène0 AOX1!!

    Merci pour tes explications....
    Alors il existe plusieurs autres techniques de sélection hormis l'antibitiotique, à l'instar de :
    - Hybridation avec une sonde radioactive.
    - Coloration à l'aide de l'opéron lactose, qui en présence d'un inducteur , le gène lac Z code pour une b- galactosidase qui a pour substrat le X- gal, lorsque ce dernier est clivé il libére la coloration bleue...l'introduction du gène d'intérêt va inactiver ce gène de b- galactosidase....et donc les clones ayant assimilé le vecteur recombinant seront blanchâtres.
    -Criblage immunologique: à l'aide d'Ac dirigé contre la protéine d'intéret ...un Ac marqué bien sur ....
    -pour les levure par exemple il y a aussi la sélection par auxotrophie : on fait muter les levures de sorte qu'elles deviennent auxotrophe pour par ex l'uracile Ura (elle aura besoin de celle ci pour se developper, elle ne peut pas la synthétiser elle même)....et on met le gène codant pour Ura dans le vecteur ..donc les levures recombinantes pourront croitre car le vecteur va leur apporter cet Ura ...


    Voili voilou ..j'éspere que j'ai été persuasive, si t'as d'autres questions n'hésite pas ..

  12. #9
    piwi

    Re : Gène0 AOX1!!

    Lopgor, je ne comprends pas comment vous parvenez à ces conclusions.
    Ce qu'il faut comprendre est plus simple. Le promoteur est inductible par le méthanol. On isole et on clone ce promoteur, on met la séquence codante que l'on veut derrière. Du coup, on crée une protéine dont l'expression est inductible par le méthanol.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    cysto

    Re : Gène0 AOX1!!

    En fait, j'ai compris, ce gène AOX c'est un gène qui lorqu'il est induit il permet l'expression de notre protéine dans un pourcentage de 30à 40 % des protéines totales ....le promoteur de ce gène est trés fort !!! et donc l'astuce est de mettre ce promoteur en amont du géne d'interêt ...
    Voilà,

  14. #11
    Lopgor

    Re : Gène0 AOX1!!

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Lopgor, je ne comprends pas comment vous parvenez à ces conclusions.
    Ce qu'il faut comprendre est plus simple. Le promoteur est inductible par le méthanol. On isole et on clone ce promoteur, on met la séquence codante que l'on veut derrière. Du coup, on crée une protéine dont l'expression est inductible par le méthanol.

    Cordialement,
    piwi
    Lorsque méthanol est présent le gène AOX1 s'exprime et code ses proteines.

    Lorsque méthanol est abscent il n'y a pas de proteines.

    Pourquoi ? Car le méthanol porte une influence sur la transcription de l'ARNm indispensable à la traduction des proteines du gène AOX1.

    Comment ? Suite à l'action d'un autre gène répresseur de AOX1. Ce gène répresseur crée une proteine qui va se liée avec l'opérateur du promoteur pour inhibé la transcription lorsque méthanol est abscent.

    Lorsque méthanol est présent elle se lie avec la proteine crée par le gène répresseur de AOX1. Cette liaison modifie la configuration de la proteine qui ne parviens plus à se fixé sur l'oprérateur du promoteur. Comme la proteine de répression ne se fixe pas la transcription a lieu.

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