Salut,
Je suis nouvelle dans ce forum, je suis doctorante en biologie humaine. J'essaie desespérement depuis quelques jours de faire un marquage immunohistochimique du récepteur opioide mu sur du tissus de colon de rat.
Est ce que quelqu'un a déjà essayé? est ce que je suis sur le bon forum? sinon connaissez vous l'adresse d'un forum pour des problemes de ce style?
Merci bcp
Sandra
Bonjour,
Tu es certainement sur le bon forum, pas de problème de ce coté là.
Par contre quel est ta question au juste? Tu veux savoir si c'est possible où tu penses avoir un problème avec ta manip'?
A bientot sur ce joyeux forum,
piwi
Eh ben les 2, en fait j'essaie de voir si je peux trouver le recepteur opioide mu de préférence dans les cellules en gobelet (ca m'arrangerai bien). Pour l'instant je n'arrive à l'avoir que dans les plexus myentériques, et j'apercois une faible coloration plus foncée à la base des cryptes et à la lumière. Mais bon j'ai sois un trop faible marquage limite douteux soit trop de bruit de fond. Je ne sais plus quoi faire (passage des lames au microonde, utilisation d'un diluant dako pour l'anticorps primaire etc)
je suis donc impuissante devant mon microscope
La fixation est elle adaptée?
Tes coupes sont en paraffine ou cryostats? (certains Ig marchent mieux sur l'une ou sur l'autre)
es tu certaine que ton Ig 1 est bien spécifique? T'as essayé de faire un western blot, juste pour voir si il reconnait bien la bonne proteine?
Ton Ig2 n'est il pas pourri? (dés fois ca arrive aussi)
Sinon tu peux tenter la nuit dans le PBS à 70°C dés fois ca marche. Y a des trucs avec posts fixations étranges, je les ai plus en tête comme ca mais ca pourrait aussi t'aider (on trouve ca sur les site des distributeurs d'Ig)
Voilou quelques pistes classiques.
Sinon, tu es certaine que la proteine est fortement exprimée là où tu cherches? Le controle positif (si tu en as un) dis quoi?
C'est de la paraffine. Concernant l'Ig1, oui il reconnait bien la bonne protéine, mon positif est bien positif. Par contre je viens de l'acheter donc je sais pas si il est super spécifique, je fais encore la mise au point, et dans la biblio ils n'ont jamais essayé de trouver ce recepteur sur les cellules en gobelet, donc en fait j'ai même pas d'images ni rien pour sa oir si ma protéine est fortement exprimée.
C'est quoi le truc du pbs à 70°C?
Merci bcp pour ton aide en tous cas
