DNAchip

[invite794baf21]

Bonjour,
Je suis très impressionné par la technique des "puces à ADN" mais il y a une chose que je n'ai pas comprise dans les cas ou on veut comparer l'expression de gènes chez une personne saine et une personne malade:
-Tout d'abord on place une sonde oligonucléotidique ou ADNc de séquence connue sur un support.
-Ensuite on prélève l'ARNm total chez la personne saine et malade. On fait de la RT PCR pour obtenir de l'ADNc (et on marque l'ADNc lors de cette étape , par exemple avec de la cyanine 3 pour le malade et de la cyanine 5 pour le non malade)
-Puis on ajoute les cDNA sur les sondes afin qu'ils s'hybrident avec leur sonde complémentaire. c'est à cette étape que j'ai un problème (en supposant dejà que les étapes que j'ai décrites précédemment soient bonnes): Faut-il faire une puce pour le malade et le sujet sain puis superposition des résultats par traitement info pour avoir des spots jaunes et de ttes les couleurs ou bien on ajoute sur la même puce les cDNA des 2 personnes?
Merci.
-----

[Vinc]

Salut!
Oui tu as bien compris la technique !
Et oui il faut faire une puc par condition c'est à dire une puce pour le malade et une puce pour le témoin. Mais il y a d'autres techniques où une seule puce suffit....
A+
Vinc

[invite794baf21]

Et dans les techniques où une seule puce suffit, comment être sûr lorsqu'on obtient un spot rouge par exemple que c'est bien parce qu'on a une surexpresion d'un gène dans une condition par rapport à l'autre et non pas parce qu'il y a eu plus d'hybridation avec l' ADNc marqué avec la Cy3?

[inviteb7174662]

Salut Eska, moi aussi je suis en train de réviser les DNAchip en ce moment ^^
ALors moi ce que j'ai sur la DNA chip c'est plutot :

1) Fabrication de la puce :
On dépose sur une lame des fragments d'ADN issus d'un génôme (souris par exemple) digéré, puis amplifiés par PCR
(je passe les détails, saturation polylysine etc)

2) Fabrication de la sonde à partir des ARN extraits de 2 cultures cellulaires de souris (deux souches de cellules différenciées et différentes ^^), dont on veut comparer l'expression des gènes.
La RT sur les ARN permet d'obtenir des ADNc.
Les ADNc de la première culture sont marqués en rouge
Les ADNc de la deuxieme culture ont un autre marquage (vert)

3) Hybridation :
Les ADNc issus des deux cultures sont mélangés et déposés sur la lame.
Si spot vert : ADNc vert hybridé (logique) ^^
si spot rouge...
Si spot jaune : Les deux ADNc (ceux issus de la premiere culture et ceux issus de la deuxieme) se sont fixés. vert + rouge.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb7174662]

Bon encore dépasser les 5 min grmbl, (voir mon post dans "Vie du Forum" ^^)

J'avais écris une tartine pour dire en bref que la technique que je décris ci dessus est dans l'objectif de comparer l'expression de deux populations de cellules.

Par contre dans la technique que décrit Eska, j'ai l'impression qu'on ne veut comparer l'expression que pour une seule protéine (puisqu'apparemment on ne fixe qu'une seule sonde Oo) or je me demandais si j'avais rien compris au schmilblick ou si il y a avait pas une technique plus simple que le DNAchip à réaliser (dans le cas d'Eska).
C'est une juste question pour info personnelle.

Cordialement.

[invite794baf21]

Salut Djelaba,
Non dans mon cas aussi c'est pour comparer l'expression dans deux populations cellulaires(l'expression de nombreux genes et non pas d'un seul gène) mais ce que tu appelles sondes dans ton petit 2, moi je l'appelerai plutôt cibles...
En fait la technique que je décris est la technique des puces affymetrix et les sondes utilisées sont des oligonucléotides synthésisés par photolithograghie (et il y a beaucoup de sondes synthésisées et non pas une seule!) alors que dans ta technique les sondes sont des ADNc obtenus après amplification par PCR...
Je se suis pas sûr cependant...

[P'tite_fleur]

Bon, Dans l'ensemble c'est ça, mais je me permettrai de rajouter quelques petites précisions :

Déjà, entendons-nous bien, on appelle "sondes" ce qui est imprimé sur la puce, et cibles ce qu'on marque et hybride dessus, héritage du vocabulaire du northern blot (je sais jamais s'il faut mettre une majuscule ... )

Il y a en gros 2 types de puces :
Style "affymetrix" (TM) où on a synthèse in situ d'oligonucléotides sur une puce. On hybride une seule condition à la fois (marquage à la biotine/streptavidine, donc une seule couleur)

"puces à ADN" ou l'on dépose sur une lame de verre de style lame de microscope des produits PCR (faits à partir de banques cDNA ou autres) ou des oligonucléotides synthétisés individuellement. On hybride alors sur ces lames 2 conditions à la fois, voire 3. Les marquages se font avec des molécules fluorescentes donc plusieurs longueurs d'ondes disponibles sur la même lame.

Pour savoir si, "si un spot est rouge c'est bien parce qu'on a une surexpresion d'un gène, etc" il faut bien se rendre compte que quand on fait des puces à ADN, c'est du "haut débit", on ne regarde pas l'image spot à spot en notant lesquels sont rouges ou verts. On applique un grille et les signaux sont quantifiés par un logiciel. On analyse alors des tableaux de données. On applique ce qu'on appelle une normalisation. Là ça devient compliqué, mais on considère que la majorité des spots ne seront pas différentiellement exprimés, et, en gros, tous les spots qui s'éloignent significativement du nuage de points sont considérés comme différentiellement exprimés.
Pour plu de détails, voir cet EXCEEEEELLLLEEENT site : INRA-URGV
Bon, je suis partiale, c'est là que je bosse
Et si vous avez d'autres questions, n'hésitez pas, je traine ici assez souvent


Arf, grillée par Eska, désolée, il y a des redites par rapport à son post

[invite794baf21]

Bonjour Ptite Fleur,
Merci pour ses renseignements (et très bon site en effet )
Et en ce qui concerne la technique SSH(suppressive substractive Hybridation), quel en est l'interet par rapport à une puce Affymetrix?

[Perine]

Coucou, moi je voulais savoir pour ma part comment lire un tableau de valeur sortant
des du scan avant de les taiter sous R, quelqun aurait un manuel ?
mERCI BIEN