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Tale nuclease



  1. #1
    aminabio

    Tale nuclease


    ------

    Bonjour, je voudrais savoir svp si quelqu'un aurais déjà entendu parler des TALENS ces des enzymes artificielles qui provoquent des cassures double brin de l'ADN je souhaite savoir si en les transfectant grce à un plasmide dans une cellules eucaryotes il faut que ce gène s’intègre a l'ADN de la cellules eucaryotes ou une simple expression transitoire suffit, Merci bcp d'avance

    -----

  2. #2
    Hellbly

    Re : Tale nuclease

    Bonjour,

    Normalement, comme avec les Zinc-Fingers Nucleases, on les injecte sous forme ARN...Je ne vois pas en quoi il serait utile d'intégrer ce système dans un génome. Il s'agit juste d'une mutagenèse dirigée. Ainsi dans mon équipe, on les utilise chez le zebrafish. On injecte le couple d'ARNm au stade 1 cellule, en espérant que la mutagenèse soit effective dans la lignée germinale pour pouvoir transmettre cette mutation et générer une descendance avec le gène d'intérêt muté.
    J'imagine que c'est sensiblement la même chose en culture cell. Ceci dit, l'expression transitoire devrait pouvoir être suffisante...c'est juste plus rapide en passant par des ARNm, il n'y a que la traduction à franchir comme étape avant d'avoir l'outil fonctionnel.

  3. #3
    aminabio

    Re : Tale nuclease

    D'accord, merci bcp pour votre réponse mais pour ce qui est de l'utilisation des ARNm : de quoi le plasmide doit être constituer
    psk jusqu'a present j'en ai jamais entendu parlé , j'ai mis dans mon protocole qu'il fallait faire une transcription inverse a partie des construction de TALENs pour obtenir l'ADNc correspondant et pouvoir les clonés puis les transfectés dans des cellules eucaryotes?

  4. #4
    Hellbly

    Re : Tale nuclease

    Mais pourquoi faire une transcription inverse (RT) des TALENs ?
    Généralement, ils sont disponibles sous forme de vecteurs. Il n'y a aucune raison de faire de la RT d'un outil moléculaire !
    Mais là, votre couple de TALENs, il est sous quelle forme ? Vous n'avez pas deux plasmides ?

  5. A voir en vidéo sur Futura
  6. #5
    aminabio

    Re : Tale nuclease

    bonjour,
    oui effectivement on a deux plasmides qui sont déjà prêt, en fait moi je suis en stage et on a demandé de réaliser a protocole expérimental pour une inactivation d'un gène spécifique dans des cellules humaine en utilisant des TALENs. et vue que je n'ai jamais utilisé cette technique ni même vu en cours je ne sais pas trop comment le faire pour moi :
    vue que les plasmides sont prêt il :
    le clonage dans des bactérie
    la transfection dans les cellules d’intérêt
    et la vérification du ressaut par PCR et séquençage
    c'est les grande ligne mais je ne suis pas dutout sure de moi

  7. #6
    aminabio

    Re : Tale nuclease

    svp, c un peu urgent car je dois rendre mon protocole ce soir, Merci

  8. #7
    Hellbly

    Re : Tale nuclease

    Ah...désolé, je suis également étudiant, de fait en journée je suis à la fac.
    Je rappelle que je n'ai jamais essayé en contexte d'expression transitoire, ni sur culture cell.
    Ok pour la transfection, mais en ce qui concerne la vérification par PCR, comment allez-vous procéder ? A partir de combien de temps allez vous récupérer l'ADN après la transfection ?
    De plus...au labo, nous utilisons un couple de talens supplémentaire comme contrôle positif de l'outil, dirigé contre un gène dont on sait que la mutagenèse marche bien.

  9. #8
    aminabio

    Re : Tale nuclease

    j'ai demandé et les talens son sous forme de plasmide prêt a l'emploi voile ce que j'ai proposé comme plan:
    - transfection pendant 48h des talens du gene d'interet et les cellules temoin ( moi j'avais mis avec vecteur sans les talens) mais pour votre par vs avez dis avec des talens qu'on sait quil marche bien (je compprend poen quoi cava ns etre utile)
    - extraction de l'ADN puis PCR avec des amorces specifique du gene d'interet puis digestion avec la nuclease T7 et migration sur gene d'agarose et comparaison avec le temoin ( le produit du digestion du gene d'interet sans l'action des talens)
    je sais pas si c'est bon?

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