Conséquence de l'intégration d'un vecteur dans une bactérie

[invite41570d8e]

Bonsoir ,

Lors d'un TP , j'ai deux souches :

- souche bactérienne recombinante : BL21/peT21(a)::calD3 nommé (+)
- souche bactérienne témoin : BL21 nommé (-)

Donc j'ai compris a peu près le système d'expression hétérologue BL21/pet.
On a ensuite :
- mis les bactéries (+) dans un tube contenant du milieu LB , de l'ampiciline , et de l'IPTG
- mis les bactéries (-) dans un tube contenant du milieu LB , et de l'IPTG

Après 4h d'incubation , on mesure la DO des deux souches. On trouve plus pour les bactéries (-) que pour les bactéries (+).
Et donc ma question c'est pourquoi ? Sincerement j'ai beau me creuser les méninges je ne comprends pas.
Je m'excuse si j'ai oublié des renseignements importants donc vous pouvez me demander.

Et merci par avance pour toutes réponses
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[noir_ecaille]

Raisonnement par l'aburde : si on incube les deux souches avec ampiciline, à quoi peut-on s'attendre et pourquoi ?

Par ailleurs il y a un apsect qui semble vous avoir échappé : comment appelle-t-on le milieu avec ampiciline par rapport à l'autre ?

[invite41570d8e]

Si on incube les deux souches avec de l'ampiciline , les bactéries (-) ne pousseront pas car elles ne possèdent pas le gène qui pourrait leur conférer une résistance à l'ampiciline ?
On appelle ça un milieu sélectif ?
Je suis désolée mais je n'arrive pas à voir en quoi cela répond à ma question

[noir_ecaille]

Et pourtant... Pourquoi est-ce qu'on appelle ce genre de milieux sélectifs ?

Une résistance n'annule pas forcément une c _ _ _ _ _ _ _ _ e

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite41570d8e]

Le problème c'est que notre prof nous a dit que la réponse ne se trouvait pas dans l'ampiciline , mais au fait que l'intégration que ce vecteur permet la production d'une protéine.

[noir_ecaille]

Je parlais d'une généralité, qui n'est pas valable que pour l'ampiciline mais pour tout milieux qualifié de sélectif -- à opposer aux milieux de croissance.

[invite519159ec]

Ce n'est pas un problème de milieu sélectif, c'est un problème de fabrication de la protéine.
Imagine, tu es en TP tu dois mener une expérience, mais le prof te dit que, en même temps, tu dois préparer les milieux pour toute ta classe. Il se passe quoi ?

[noir_ecaille]

Ce n'est pas un problème de milieu sélectif, c'est un problème de fabrication de la protéine.
Imagine, tu es en TP tu dois mener une expérience, mais le prof te dit que, en même temps, tu dois préparer les milieux pour toute ta classe. Il se passe quoi ?

Travail de groupe. Préparation à la professionnalisation individuel et collective.

Lors d'un TP , j'ai deux souches :

- souche bactérienne recombinante : BL21/peT21(a)::calD3 nommé (+)
- souche bactérienne témoin : BL21 nommé (-)

Donc j'ai compris a peu près le système d'expression hétérologue BL21/pet.
On a ensuite :
- mis les bactéries (+) dans un tube contenant du milieu LB , de l'ampiciline , et de l'IPTG
- mis les bactéries (-) dans un tube contenant du milieu LB , et de l'IPTG

Après 4h d'incubation , on mesure la DO des deux souches. On trouve plus pour les bactéries (-) que pour les bactéries (+).
Et donc ma question c'est pourquoi ? Sincerement j'ai beau me creuser les méninges je ne comprends pas.

Allons-y pour ce qu'il se passe pour cette différence entre souches bactériennes recombinante et témoin... Deux facteurs :

1. Le milieu avec ampiciline est un milieu sélectif, i.e. la croissance "normale" bactérienne subit une contrainte inhibante. Même avec une résistance, la croissance est toujours contrainte puisque :
   • Il faut des ressources supplémentaires pour synthétiser l'outil de résistance (enzyme lysant l'antibiotique, protéine effectutant un repliement supplémentaire sur la protéine ciblée par l'antibiotique, etc) ==> baisse de la croissance
     
   • Éventuellement s'il s'agit d'une amélioration d'affinité au substrat, on garde "souvent" un peu de compétition inhibitrice de la part de l'antibiotique ==> baisse de la croissance
     
   • Une bactérie incapable d'utiliser un antibiotique donné comme ressource va donc "immobiliser" une partie des ressources extraites du milieu. C'est une perte de ressources pour la croissance pure puisque sacrifiée à la résistance, or notre milieu de culture n'a qu'une quantité finie de ressources ==> plateau final inférieur à une croissance sans antibiotique
2. La résistance est portée par un plasmide. Or ce dernier n'est pas toujours transmis à chaque cellule fille durant la scissiparité bactérienne. On a donc des pertes supplémentaires car les bactéries filles sans plasmide vont être sensibles à l'antibiotique. C'est d'ailleurs un fait tellement connu qu'on se sert (presque ?) systématiquement d'une résistance à un antibiotique donné comme marqueur et sélection des bactéries transformées.

Voilà. J'espère avoir clarifié les facteurs en jeu dans ce différentiel de croissance


PS : N'hésitez pas à poser des questions supplémentaires

[invite519159ec]

Oui c'est ça que je voulais qu'elle comprenne toute seule : si elle a plus de boulot à faire que les autres du TP elle mettra plus de temps --> la bactérie qui doit fabriquer le plasmide et synthétiser la protéine est ralentie dans sa multiplication

C'est aussi pour ça qu'une souche résistante perdra son plasmide si on la fait pousser sur un milieu non sélectif. Les bactéries qui ne multiplient pas le plasmide pousseront plus vite que les bactéries l'ayant perdu accidentellement, et au bout d'un moment il n'y a plus que celles qui se multiplient le plus activement.

[noir_ecaille]

@ Solyca

Je n'avais pas compris que les TP étaient une métaphore...

[Flyingbike]

C'est aussi pour ça qu'une souche résistante perdra son plasmide si on la fait pousser sur un milieu non sélectif. Les bactéries qui ne multiplient pas le plasmide pousseront plus vite que les bactéries l'ayant perdu accidentellement, et au bout d'un moment il n'y a plus que celles qui se multiplient le plus activement.

Est-ce une réalité chez les procaryotes ? ou juste une théorie personnelle ? (question honnête hein)

[invite519159ec]

C'est une réalité, c'est pour ça que quand on a une souche résistante il ne faut jamais la multiplier sur milieu non sélectif.

Seule exception : quand on transforme une souche avec un plasmide, il faut la laisser un moment (45 minutes il me semble) en milieu non sélectif, pour qu'elle ait le temps d'exprimer la protéine de résistance. Mais elle n'a alors pas le temps de se diviser et de perdre le plaqmide.

[invitec9f0f895]

Est-ce une réalité chez les procaryotes ? ou juste une théorie personnelle ? (question honnête hein)

Je suis comme Flyingbike, un peu surpris par cette affirmation!
Juste un rapide calcul:
Taille du génome de E. coli: 4,6 Mbp, nombre de protéines estimé aux alentours de 4000.
Donc pour un plasmide qui ferait disons 4,6kb cela représente donc 1‰ du génome! Si le plasmide code 4 protéines là aussi on est à 1‰. Cela me semble totalement négligeable pour une cellule. Mais bon peut etre que je me montre.

YOyo

[invite519159ec]

En fait les plasmides portant les résistances sont "multi-copies". Ce qui veut dire que dans chaque bactérie il y a un nombre très important de plasmides (100 à 300 je crois). C'est ce qui est intéressant quand on veut multiplier un fragment d'ADN.
Quand la bactérie se divise, un nombre aléatoire de plasmides va dans chaque cellule fille. Ensuite la bactérie re-multiplie les plasmides en même temps que son propre génome avant de se re-diviser.
S'il n'y a pas d'antibiotique dans le milieu, la cellule fille qui aura reçu moins de plasmides va se multiplier plus vite. Et ce à chaque génération.
On arrive à la fin à des bactéries très appauvries en plasmides, voire avec des plasmides tronqués.

[invite14397db8]

Je suis comme Flyingbike, un peu surpris par cette affirmation!
Juste un rapide calcul:
Taille du génome de E. coli: 4,6 Mbp, nombre de protéines estimé aux alentours de 4000.
Donc pour un plasmide qui ferait disons 4,6kb cela représente donc 1‰ du génome! Si le plasmide code 4 protéines là aussi on est à 1‰. Cela me semble totalement négligeable pour une cellule. Mais bon peut etre que je me montre.

YOyo

Cela ne l'est pas dans une population de milliards de milliards de cellules se reproduisant vite, une petite différence au départ peut conférer finalement un avantage non négligeable. Sans parler des questions de plasmide multi-copies. C'est un principe général, on enlève la pression de sélection, le gène de résistance subit la dérive, voire même est contre-sélectionner si son maintien/ expression a un coup.