Microscope confocal et moisissures ?

[William.Billaud]

Bonjour à tous,

Je suis actuellement étudiant en seconde année de DUT Génie Biologique. En fin de semestre 3, nous devons (par trinôme) rendre un rapport d'une dizaine de page sur le sujet "Croissance des moisissures et analyse d'images". Pour l'instant, nous nous occupons uniquement de l'aspect croissance. C'est pourquoi nous recherchons des techniques permettant de dénombrer ou d'obtenir une valeur de la biomasse des moisissures.
Je m'occupe de la partie "Mesures directes", dans laquelle il y a :
- La mesure du thalle (si vous aviez un lien expliquant comment se développe le thalle de façon assez "simple" je suis intéressé !)
- Le microscope confocal (à balayage ?)
Ce dernier pose problème. J'ai pensé qu'il était possible d'obtenir le volume d'une moisissure grâce à cette appareil. Si j'ai bien compris, on obtient la valeur du x,y et z du produit analysé, je suppose donc qu'il existe des logiciels intégrés à l'appareil permettant d'obtenir a valeur qui nous intéresse. Mais je commence à douter, est-il réellement possible de l'utiliser pour des moisissures ? Si oui, dans quelles conditions (suspensions ou prélèvement direct)?
Serait-il possible que vous me donniez un principe "simplifié" du fonctionnement de cette technique ? Il existe plusieurs documents sur internet mais ils sont (presque tous) payants...

Je vous remercie et vous souhaite une bonne journée !
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[noir_ecaille]

Il s'agit de quelle type de moisissures ? Saprohytes, alimentaires, autres ?


Pour une étude de croissance, une alternative simple serait le dénombrement de thalles (sur milieu solide) à partir de prélèvements successifs (à intervalles chronométrés) issus du même milieu de croissance (liquide). Bien sûr il ne faut pas oublier de diluer les prélèvements comme il faut, sinon on se retrouve vite avec des boîtes indénombrables. On réalise trois dillutions par prélèvement (attention à bien calculer ces dillutions !).

Les géloses :

De base, on peut carrément prendre la gélose PCA mais en ajustant le pH à 5,6 au lieu de 7, voire en montant aussi la concentration en glucose à 0,5%. PCA est le milieu (non spécifique) de dénombrement par excellence.

Il y a les géloses Sabouraud, grand classique en mycologie principalement alimentaire. Tout dépend quel glucide on intègre à la préparation :
- glucose
- maltose
- saccharose
Pas tout à fait un milieu pour la numération mais pratique pour isoler et cultiver les moisissures (et les levures). Il arrive qu'on additionne du chloramphenicol, ou de la gentamicine ou un autre antibiotique à hauteur de 0,05g/L.

La gélose PDA (potato dextrose agar) est un autre grand classique de la mycologie alimentaire. Davantage fait pour la numération que Sabouraud, la fécule de pomme de terre va un peu "tamponner" l'évolution du pH.

La gélose à l'extrait de malt est presqu'équivalente à une Sabouraud au maltose, avec cependant moins de glucide dans sa composition.

Ensuite il y a tout un tas d'autres géloses de numération des moisissures et levures plus ou moins spécifiques :
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...0&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...0&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...=CM0097&org=74
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...9&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...9&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...7&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...8&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...5&c=UK&lang=EN
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...1&c=UK&lang=EN


Par contre, j'ai du mal à voir ce que vous souhaiteriez faire avec un microscope confocal concernant une "mesure" de biomoasse.

Le principe simplifié ici : http://www.futura-sciences.com/magaz...confocal-7777/

[William.Billaud]

Merci de ta réponse !

Pour l'instant il n'y a pas de conditions concernant la moisissure, on doit juste faire une liste des techniques possibles nous permettant de mesurer la croissance. Nous en avons trouvés quelques unes et j'ai hérité des mesures directes, c'est pour ça que le microscope confocal semblait être une possibilité.

D'après ce que j'avais trouver sur son fonctionnement, il permet, suite à un traitement informatique, d'obtenir une image 3D du produit analysé. On pourrait donc, à partir du x, y et z, calculer un volume non ? On le ferait à J0 puis plusieurs fois afin de comparer. Je ne sais pas si c'est réellement possible, et le prof qui s'occupe de nous n'est pas très au courant de ce domaine, c'est pourquoi je m'adresse à vous.

"Pour une étude de croissance, une alternative simple serait le dénombrement de thalles (sur milieu solide) à partir de prélèvements successifs (à intervalles chronométrés) issus du même milieu de croissance (liquide). Bien sûr il ne faut pas oublier de diluer les prélèvements comme il faut, sinon on se retrouve vite avec des boîtes indénombrables. On réalise trois dillutions par prélèvement (attention à bien calculer ces dillutions !)."
- Qu'entends tu par dénombrement ? Pour nous, le thalle était exploitable pour une simple mesure à l'aide d'un pied à coulisse que nous aurions fait plusieurs fois dans la journée ou dans la semaine...Ce serait donc une autre technique complétement à part ?

[noir_ecaille]

Par dénombrement de thalles, j'entends bien de compter des petits thalles, ce qui donne une mesure UFC (= unité faisant colonie) de la croissance. En gros, on innocule un bouillon de croissance qu'on garde homogène par agitation et on effectue des prélèvements à intervalles réguliers et enregistrés. Reste à "linéariser" les UFC/temps d'incub et la pente donne la vitesse max. C'est d'autant plus intéressant/proche quant à la vitesse réelle de croissance du fait qu'il y a beaucoup moins d'inhibition de contact (donc on s'approche de la vitesse de croissance maximum en terme de mesure de la biomasse), contrairement à par exemple un plein thalle dont on mesurerait le diamètre.

C'est donc une technique complètement à part et plus spécifique au métabolisme idéallement "max" de croissance, que tributaire de facteurs d'inhibition (donc une vitesse moins spécifique). Donc pour une mesure de vitesse maximale de croissance, il vous faudra utiliser cette technique.

Par ailleurs, plus un gros thalle grandit, moins il s'approche de sa vitesse maximale de croissance puisque :
- les ressources sous le thalle vont vite s'épuiser (question d'épaisseur limitée de la gélose)
- les ressources en périphérie vont en (grosse ?) partie être redistribuée à travers le mycellium jusqu'au centre du thalle
- même sans avoir envahi/recouvert la gélose (diamètre du thalle ≥ 1 cm), le milieu à portée immédiate du gros thalle devient peu à peu moins favorable (pauvre, saturé en déchets...)
- le manque de ressources induit une sporullation (détournement du métabolisme, donc moins de croissance)

La croissance d'un plein thalle central peut par contre servir à étudier ce qui se passe en fin de croissance.


Concernant la microscopie confocale, en résumé vous souhaiteriez isoler un bout de mycellium sous lame, et filmer son développement ? Question "volume" (biomasse ?), j'ignore si c'est fiable

[A voir en vidéo sur Futura]

[William.Billaud]

Génial, une nouvelle technique ! je te remercie beaucoup !

Pour le microscope, ce serait l'idée oui. Le problème est que ce genre d'appareil est assez rare et avoir des informations dessus est assez complexe...c'est pourquoi nous ne savons pas si on doit le considérer comme une technique...

[balloune]

Le thalle tout comme les ronds de sorcière sur les pelouses, tout comme les mycoses sur la peau etc... se développe forcément sous forme d'un disque fait d'entrelacs d'hyphes (les filaments). Et cela car les hyphes ont une croissance apicale et radiale.

Les approches les plus simples consistent en inoculer un nombre de spores précis sur une boite de Petri gélosée (faire des répétitions) et (i) mesurer la croissance radiale du thalle ou (ii) prendre les masses sèches ou (iii) aller mesurer l'accumulation d'un composé tel que l'ergostérol qui est membranaire et qui reflète bien la biomasse fongique (il existe un grand nombre d'articles scientifiques sur le sujet).

Il existe d'autres techniques bien plus complexes mais la microscopie 3D ne serait pas un très bonne idée à mon sens.

HTH