Pam
Bonjour,
étudiant en L3 Biochimie je m'intéresse également au complexe CRISPR/Cas9. J'ai lu plusieurs review et articles pour préparer une présentation et voici quelques informations qui me paraissent utiles.
Il a récemment été démontré que la reconnaissance de la séquence d'ADN cible se fait dans un premier temps via un Protospacer Adjacent Motif (PAM). Ce motif est uniquement présent chez le pathogène, ce qui garantit que le complexe crRNA+tracrRNA+Cas9 ne dégrade pas l'ADN de l'hôte. Une unique mutation dans ce motif relativement court ( < 5 Nt), inactive la reconnaissance. Bien entendu dans un second temps c'est le spacer présent sur crRNA qui va finaliser la reconnaissance. Source: Sternberg et al. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9 Nature 2014.
L'intérêt de cette reconnaissance, c'est qu'elle garantit une grande spécificité, comparé aux autres méthodes dévellopées: méganucléase, TALEN, et Zinc Finger. Ces méthodes se basent sur une reconnaissance Protéine-ADN alors que les CRISPR permettent une reconnaissance ARN-ADN. De plus il est possible d'intégrer plusieurs séquences cibles! Remarque: dans le cadre de l'ingénierie génétique le complexe CRISPR-Cas9 a été optimisé en fusionnant le crRNA et le tracrRNA pour obtenir un guide ARN chimérique le cgRNA.
Certains points me posent problème:
Où se trouve le le domaine reconnaissant la séquence PAM (PAM-Interacting Domain) ! J'ai lu que la reconnaissance se faisait via une reconnaissance de la structure 3D ( Garside & MacMillan Cas9 in close-up Nature Biotechnology 2014) la publication contenait également un schéma laissant penser que ce domaine se trouvait sur une structure secondaire du tracrRNA.
Pour améliorer la spécificité lors de recombinaisons homologues, l'utilisation de deux complexes CRISPR/Cas9 mutés en nickase entrainant chacune une cassure simple brin sur l'un des brins ( contre une cassure double brin pour le complexe de base) a été devellopé. En quoi cette méthode garantit-elle une plus grande spécificité?
Ce sont des considérations assez technique, je peux ouvrir une nouvelle discussion si besoin
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