comment connaitre le nombre de cellule dans une colonie?

[inviteee640739]

bonjour, je doit mettre en place un test de détection rapide de resistance a l AMP par betalactamase, grace a deux souche E. coli modifié. une une codant la GFP(KAN+) et l'autre la RFP (AMP+).
en fait je les ais sur boite de petri, mon probleme c'est qu il me faudrai connaitre précisément le nombre de celulle que j ensemence.
on ma dit que dans une colonie il y a 10[EXP]12 cellules. les deux possibilités que je voit sont par turbidimetrie ou par ensemencement dans la masse sur milieu.
Que doit je faire?
merci d avance
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[invite4eedc1ec]

Bonjour,
je pense que la turbidimétrie est une bone solution déjà utilisée pour des méthodes d'identification qui réclament un ensemecement minimum et maximum
par contre je ne vois pas ce que tu veux obtenir en faisant un ensemencement dans la masse DANS un milieu?

[invite88fb5c76]

tu connaitra jamais precisement le nombre de bacteries que tu ensemence...

mais tu peu savoir a peu pres avec des techniques de denombrement.


tu peu faire ainsi:

tu fais une suspension bacterienne, tu estime la consentration bacterienne, puis une serie de dilution, et tu fais tes denombrements.

en parrallele avec la tu fais test avec une plage de dilution qui te va bien et puis c'est tout.


ou mieux...il faut etre deux
pendant que toi tu encemence tes galeries... tu demande a un assistant de compter en direct ta suspension au microscope sur lame de malssez.

(si tu prepars bien et que tu fais des essais et des tests de reproductibilité sa va le faire )

[invite533a42a8]

Le problème du test par dilution est qu'il faut faire beaucoup de répétition car le résultat est peu précis

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8ac0b7c1]

Lorsque l'on cultive des cellules, pour connaitre le nombre, on dilue notre milieu, on colore celui ci par du bleu trypan qui colore les noyau en bleu si la cellule est morte. ensuite on place une goutte sur une cellule de Malassez (une lame de microscope ou il y a des cases pour compter) On compte le nombre de cellules vivantes, et avec les dilution on remonte au milieu intiale. Je sais pas si ca t'aidera.

[invite88fb5c76]

Bien la coloration des cellules mort...sinon on risque de totalisé les vivant et les mort...

lorsque je l'ai utilisé j'avais pas ce colorant et sa nous a poser certain probleme. Merci pour l'info

[invitece4c4d59]

Lorsque l'on cultive des cellules, pour connaitre le nombre, on dilue notre milieu, on colore celui ci par du bleu trypan qui colore les noyau en bleu si la cellule est morte. ensuite on place une goutte sur une cellule de Malassez (une lame de microscope ou il y a des cases pour compter) On compte le nombre de cellules vivantes, et avec les dilution on remonte au milieu intiale. Je sais pas si ca t'aidera.

à mon avis ça va pas vraiment l'aider car la technique que tu décrit est utilisé en culture cellulaire, il est illusoire de vouloir l'utiliser en bactério.

pour ton test une DO600, suivi de plusieurs dilutions pour la même condition doit être la technique la plus simple.

et de tout façon tu dois faire un témoins sans antibio qui te donnera aprés coup la concentration exact de ta solution de départ en UFC (Unité formant colonie)