Co-Immunoprecipitation

[invite69704257]

Bonjour,

J'ai une question très naïve... Lors d'une co-immunoprecipitation, dans le lysat, on se retrouve avec une protéine A que l'on précipite qui est liée avec son partenaire B que l'on détecte en western blot. Cependant si dans les cellules/tissus lysés il y a une portion de A et de B qui ne sont pas liés ensemble, est ce que le complexe A-B peut se former après lyse des tissus (dans mon tube)? En conséquence, est ce qu'une co-immunoprécipitation peut être quantitative c'est à dire est ce que dans deux coditions expérimentales on peut dire si la portion de complexe A-B augmente par rapport aux forme A et B libres.

Je ne sais pas si ma question est très claire mais merci d'avance pour votre aide!

Nicola
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[invite2eb5a45f]

Bonjour,

tout à fait, selon les conditions de lyse et d'IP, les complexes protéiques sont susceptibles de se dissocier et de se reformer après la lyse et au cours du binding lors de l'IP. Cela étant dit, dans la majorité des cas, la situation est très largement en faveur de la séparation des complexes. En effet, le volume utilisé de lyse/d'IP est très largement supérieur au volume de cellules initial, et en conséquence, la concentration en protéine A et B est largement inférieure dans le lysat que dans la cellule, ce qui déplace l'équilibre du côté de la dissociation. La dissociation étant un phénomène qui ne dépend pas des concentrations (notion de koff), lorsqu'elle est très majoritaire vis à vis de l'association, l'expérience donne tout de même des résultats quantitatifs si l'on compare deux conditions.

Un bon contre exemple à ce type d'analyse concerne les complexes impliquant deux partenaires qui ne sont pas présents dans les mêmes compartiments cellulaires. En particulier, des protéines cytoplasmiques et mitochondriales ne se croisent que très rarement (car les protéines mitochondriales sont en théorie rapidement adressées et incorporées dans la mitochondrie). L'évolution n'a pas de prise sur ce type de complexe donc, et on peut tout à fait observer la formation de complexes de ce genre post-lyse, avec des affinités assez fortes. On a donc affaire à des complexes formés après la lyse, stables, mais malgré tout sans réalité biologique. Il est cependant loin d'être évident de distinguer une interaction "légitime" d'une interaction "illégitime".