Bonjour à tous les forumeurs,
Pour "fixer" des macrophages humains ou murins, j'utilise du PFA 3% (paraformaldéhyde) que j'ai aliquoté et conservé à -20°C.
J'entends plusieurs personnes me dire que le PFA ne doit pas etre réutilisé après décongélation. Effectivement, il a tendance à détacher mes macrophages de mes lamelles en verres.
Par simple curiosité, je souhaite en connaître la raison.
Merci d'avance.
Salut!
Perso je conserve ma PAF à 4°C et pas à -20... Par contre le stock (à 16% je crois) est lui conservé à -20.
Vinc
Primum non nocere.
Yep, apparemment les deux se font Vinc. Pas d'informations concernant sa stabilité quand il est conservé à RT ?
Yep idem. 16% à -20°C.Envoyé par Vinc
Il se conserve mal à 4%, et on le garde à 4°C (pourquoi? je ne sais pas, je suppose qu'il supporte mal la décongélation), mais pas plus d'une semaine.
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
OK merci. Donc en théorie, une semaine à 4°C, il tient.
Pourquoi utilisez vous une concentration aussi élevée ? Fixation cellulaire ou rien à voir ? Si oui combien de temps ?
Non moi je la garde beaucoup plus qu'une semaine (plusieurs semaines/mois), à l'obscurité et mes collègues aussi... Pas eu de souçis pour le moment!
Vinc
Primum non nocere.
Très mauvais pour la fixation.
En fait, ce que l'on appelle PFA est la poudre. En solution elle donne du formol. Et finalement ce que l'on appelle communément de la PFA X% est une solution de formol classique.
Seulement cette solution n'est pas stable et se décompose en acide formique. Donc on pert le fixateur (formol) au profit d'un acide. La demi-vie est de 4-5j (de mémoire). Du coup passé ce delai la titration de votre fixateur est fausse.
Une autre chose: la PFA se prépare en milieu légèrement basique et à chaud. Cependant la température ne doit idéalement pas excéder 60°C, faute de quoi on a aussi formation d'acide formique.
Conclusion: En général, on préfere aliquoter une solution concentrée (10x-20x) afin de réduire les volumes de sotckages et on dilue une petite quantité au dernier moment avant la fixation. On peut conserver quelques jours la dilution si il en reste.
L'autre interet est d'utiliser un même lot de solution de fixation que l'on ne fait que rediluer. Ca homogénéise les manip'.
Notez bien que tout ceci peut paraitre lourd mais ca n'est pas trivial. En histologie la différence de qualité de fixation peut faire toute la différence.
Cordialement,
piwi
Tout à fait le type de réponse que j'attendais.
Effectivement, quand nous préparons la solution de PFA, nous la préparons à chaud en milieu basique (on réajuste à pH 7.4 au dernier moment avec de la soude).
On prépare des aliquot de 2ml environ juste après et on congèle l'ensemble.
Je ne savais pas qu'il y avait transformation en acide. Gme coucherai moins bête ce soir. Je comprends maintenant pourquoi mes cellules adhérentes n'aimait pas le "vieux" PFA
Merci encore
