Plasmide et gène LacZ

[pedrolito]

Voilà je vous fait parvenir une partie d'un cours fait par mon prof de biologie moléculaire j'aimerais savoir le sens de ces quelques phrases :
"La première étape de l’utilisation des plasmides est la détermination des bactéries transformant (qui ont intégré un plasmide non recombinant) et des bactéries transformant recombinant (qui ont intégré des plasmides recombinant, i.e. contenant le gène luc), par rapport aux bactéries non transformant. Pour cela on utilise un gène de sélection. Le plasmide ci-dessus possède un gène " Ampr ", qui procure à la bactérie un caractère de résistance à un antibiotique : l’ampicilline. En milieu contenant de l’ampicilline, seules les bactéries ayant intégré le plasmide pourront survivre. Ensuite pour différencier les transformant des non transformant, on utilise un autre gène de sélection, par exemple le gène LacZ (non présent ici) qui a la propriété de produire une substance bleue s’il est transcrit et traduit. Le gène luc étant inséré au milieu du gène LacZ, celui-ci ne peut être fonctionnel que dans le cas où le plasmide ne serait pas recombinant. Au final, dans un milieu contenant de l’ampicilline et le substrat pour le gène LacZ (X-gal et IPTG), on sélectionnera les colonies bactériennes blanches qui seront recombinant (les bleues ne seront que transformant).

Une fois les bactéries sélectionnées, il va falloir purifier les vecteurs, afin que l’ADN soit exempt de toute protéine, de tout ARN ou d’une quelconque contamination chimique. Puis, avant de commencer les expériences proprement dites, on transfecte les plasmides dans les cellules qui nous intéressent. "


Merci d'avance si je pouvais avoir une réponse rapide notamment sur la différence entre bactéties transformant et non transformant.

[orthank]

Hello,

Envoyé par pedrolito

Ensuite pour différencier les transformant des non transformant, on utilise un autre gène de sélection, par exemple le gène LacZ (non présent ici) qui a la propriété de produire une substance bleue s’il est transcrit et traduit.

Je pense qu'il y a une erreur parce que les bactéries non transformantes ont déjà été éliminées par l'action de l'antibiotique (Amp). Le système LacZ permet de différencier les bactéries (ou colonies) qui ont un plasmide avec l'insert (bactéries transformantes recombinantes) et celle qui ont le plasmide sans l'insert (bactéries transformantes non recombinantes) de part la couleur des colonies observées sur boîte de Pétri (si le milieu est préparé avec de l'IPTG et du XGal).
Une colonie de couleur blanche correspond à une colonie de bactéries transformantes recombinantes et une colonie bleue correspond à une colonie de bactéries transformantes non recombinantes.
Si je n'ai pas vraiment répondu, n'hésite pas à préciser ce qui ne va pas!

[pedrolito]

Merci bien.