Mutagenèse saturante

[zwitterion]

Bonjour,

Est ce que quelqu'un parmi vous pourrait me dire quelques mots sur cette technique, et notament ses avantages et inconvénients, par rapport à la mutagenèse aléatoire par PCR ?

Je vous remercie d'avance !

Zwitt, qui n'a pas encore accès aux revues on-line

[9herve]

Bin euh.........
La mutagénèse saturante n'a rien à voir avec la PCR.....
Quand tu veux saturer "un" chromosome par ex, tu effectues une mutagénèse (selon les organismes, chimique : EMS ENU, physique: rayons X, ou plus biologique : transposons) de telle manière que tu obtiennes un nombre suffisament important de lignées mutantes que tous les gènes du chromosomes portent une mutation.

[zwitterion]

OK merci ! mais euh, concrétement, comment tu fais pour saturer juste un seul chromosome (précison, chui pas du tout un crac en génét et en bio mol !) ?

[Steph]

Oulà, ce sont 2 choses très différentes!
La mutagenèse de saturation touche une partie entière du génome, par PCR on n'est pas encore capable de fabriquer de si grands morceaux! En outre, elle sert à rechercher le ou les gènes impliqués dans une fonction particulière d'une organisme (ou dans la régulation de l'expression des gènes). En PCR mutagenesis, on cherche plutôt les régions d'une protéine qui déterminent une fonction particulière de cette protéine.
Disons que la première scanne large, la seconde scanne une protéine donnée.
Un avantage que je percois est le taux de mutations. Par PCR, tu ne peux pas trop altérer ton mélange de nucléotides, sinon ca ne fonctionne plus bien et tu ne peux pas exagérer le nombre de cycles. Le taux de mutations est donc inférieur à 1% si je me souviens bien (donc tu ne peux pas le faire ca sur une séquence de 100bp par exemple). Il existe pour les séquences très courtes une PCR aléatoire dite par "cassette" (cassette mutagenesis), qui fait appel au clonage d'une courte séquence dégénérée. Là les taux sont très contrôlés et peuvent atteindre 100% si tu le désires, la limitation étant la taille de la cassette.

J'espère que ca t'a aidé. Sinon, sans accès aux revues, tu peux déjà trouver pas mal de renseignements sur internet.

Stéphane

[Yoyo]

Salut,

Pour précision, quand tu fais une muta saturante, le terme saturant signifie simplement que tu es sur d'avoir muté au moins une fois chaque gene. Alors attention ces mutations sont presentent dans des cellules differentes. C'est une population de cellules a qui tu fais subir la mutagenese.
Donc il te faut calculer le nombre de cellules necessaire pour etre exhaustif (en fonction de la taille du genome, de l'efficacité de mutagenese etc..) en general on estime que si tu as 3 fois la taille du genome en cellules mutantes tu as statistiquement tous les genes mutés. Apres certains seront letaux mais c'est un autre probleme.

Pour steph, une solution pour la PCR muta est aussi d'ajouter du Mn²⁺ voir de remplacer totalement le Mg²⁺ par du Mn²⁺. Car le manganese fait que les taq polymerases font plus d'erreurs.

Yoyo

[zwitterion]

OK ! merci beaucoup ! rassurez vous, ce n'est pas une question vitale pour moi, mais ce terme lu quelque part avait excité ma curiosité !

Zwitt

[9herve]

Salut,

Pour précision, quand tu fais une muta saturante, le terme saturant signifie simplement que tu es sur d'avoir muté au moins une fois chaque gene. Alors attention ces mutations sont presentent dans des cellules differentes. C'est une population de cellules a qui tu fais subir la mutagenese.
Donc il te faut calculer le nombre de cellules necessaire pour etre exhaustif (en fonction de la taille du genome, de l'efficacité de mutagenese etc..) en general on estime que si tu as 3 fois la taille du genome en cellules mutantes tu as statistiquement tous les genes mutés. Apres certains seront letaux mais c'est un autre probleme.

Pour steph, une solution pour la PCR muta est aussi d'ajouter du Mn²⁺ voir de remplacer totalement le Mg²⁺ par du Mn²⁺. Car le manganese fait que les taq polymerases font plus d'erreurs.

Yoyo

J'ai du mal à vous suivre, où intervient la PCR? vos parlez de bactéries, de levure, de cellules ES?

[Yoyo]

Bonsoir,

normal y'a deux discussions en une
la mutagenese aleatoire comme tu l'as tres bien decrite,
et je rajoutais simplement pour steph que pour le PCR aleatoire tu pouvais sur autre chose que les dNTP.

yoyo