mutation génétique

[Bacillus 100]

Bonjour,

J’ai besoin de votre aide :

J’étudie un fragment de CDNA d’un patient X atteint d’une maladie X sur lequel je recherche des mutations génétiques. Ce fragment code pour une protéine importante, sa mutation provoquerait systématiquement la maladie. Phénotypiquement le patient présente le syndrome typique de la maladie donc on devrait retrouver une mutation sur cette protéine. Mais j’ai un petit problème pour la détection et j’aimerais connaître l’avis de plusieurs personnes.

Alors voila techniquement ce que je fais:

1-culture les fibroblastes
2-extraction ARN
3-RT-PCR
4-PCR du fragment de CDNA d’intérêt à l’aide de 11 primers donc au total 11 PCR
5-Vérification sur gel agarose de l’amplification des 11 segments du fragment de CDNA d’intérêt

Voici mon problème :

Sur Gel j’obtiens une amplification (bande assez intense) seulement pour le 11ème segments, pour 3 autres segments j’ai une bande mais très très faibles en intensités.

Ces résultats m’ont conduit à répéter 2 fois la même manips depuis l’extraction et toujours le même résultat.

Ces résultats m’ont également conduit à faire des PCR témoins, j’ai donc réaliser la même technique sur :
Un patient génétiquement porteurs de la maladie et un autres patients non malade et la j’obtient une amplification (bandes assez intenses) de tout les segments !!

Moi voila ce que je pense et ce que je compte faire :

D’abord je vais séquencer directement un ou deux des exons directement sur l’ADN génomique pour voir si l’amplification fonctionne.

Si l’amplification fonctionne sur l’ADN génomique et bien je remettrais en cause l’expression transcriptionnel de l’ARN et probablement une mutation sur le promoteur et/ou les éléments régulateurs qui contrôle le CDNA mais sa n’expliquerais toujours pas pourquoi une partie de l’ARN est plus transcrite qu’une autre (le segment 11) et est ce que cela est possible dans la nature, transcrire un exon plus qu’un autre sachant que les deux exons sont sous le contrôle d’un même promoteur ??

Et si sa fonctionne pas ??? une mutation dans tous les segments ?? non peu de chances

Qu’est ce qui peut expliquer pourquoi l’amplification d’une seul région du CDNA et pas les autres d’où sa vient ??

Voila merci pour vos réponses

[jmbowie]

Peut-être que les exons moins transcrits sont les plus éloignés du promoteurs ? Dans ce cas, il y aurait des structures qui joueraient le rôle d'atténuateur de transcription.
C'est peut-être lié à une différence d'efficacité de la reverse-transcription du fait par exemple d'un fort biais dans la teneur en G+C d'un exon à l'autre (tu fais bien ta RT en random hexamer?).

[Yoyo]

Salut

A moins que tu ne fasses de la PCR quantitative ou semi-quantitative meme une grosse difference d'ampli ne te permet pas de dire que tes segments sont exprimés de maniere différente. La PCR n'est pas quantitative.

Pourquoi amplifier 11 segments de ton ARN? tous tes segments a amplifier font la meme taille? le 11eme se situe ou sur l'ARN?

Yoyo

[jmbowie]

Salut

A moins que tu ne fasses de la PCR quantitative ou semi-quantitative meme une grosse difference d'ampli ne te permet pas de dire que tes segments sont exprimés de maniere différente. La PCR n'est pas quantitative.

Pourquoi amplifier 11 segments de ton ARN? tous tes segments a amplifier font la meme taille? le 11eme se situe ou sur l'ARN?

Yoyo

Ceci dit, il n'a pas la même différence de signal quand il amplifie de l'ADN génomique, ce qui en principe exclue les différence d'efficacité des amplifications: il faudrait vérifier que les amplifications sont vraiment toutes également efficaces en partant de moisn d'ADN génomique au départ et/ou en déposant des dilutions de tes produits de PCR génomiques, car il est probable que le fort signal que tu vois pour chaque soit saturant même pour le produit le moins efficacement amplifié.

[Yoyo]

salut

non ca n'exclue pas les differences d'amplification! car il est possible que la PCR soitt deja saturante sur l'ADNg, alors que les quantités limités d'ARN limiteraient les amplifications.

Je ne serais pas surpris que les problemes proviennent de la RT.

Yoyo

[jmbowie]

salut

non ca n'exclue pas les differences d'amplification! car il est possible que la PCR soitt deja saturante sur l'ADNg, alors que les quantités limités d'ARN limiteraient les amplifications.

Je ne serais pas surpris que les problemes proviennent de la RT.

Yoyo

Idem

En arriver à la même conclusion que Yoyo, c'est une sorte de consécration nan? J'ai pas le droit à un Yoyo d'or? (ou d'argent?

[Bacillus 100]

Salut

A moins que tu ne fasses de la PCR quantitative ou semi-quantitative meme une grosse difference d'ampli ne te permet pas de dire que tes segments sont exprimés de maniere différente. La PCR n'est pas quantitative.

Pourquoi amplifier 11 segments de ton ARN? tous tes segments a amplifier font la meme taille? le 11eme se situe ou sur l'ARN?

Yoyo

Non tous mes segments ne font pas la même taille ils se situent entre 280 et 500pb. J'amplifie 11 segments de mon cDNA ce qui correspond à tout les exons ciblés sur l'ADNg qui code pour la protéine d'intérêt. 11 fois car le séquenceur ne permet pas de lire au dela de 700pb alors on segmente. Le 11 ème segment correspont au 2 derniers exons (extrémité 3').
Oui faudrait peut être faire de la PCR Q, mais ici qu'est ce qui explique que quand j'amplifie la même région d'interêt CDNA des autres patients (la région est exactement la même hormis les SNP et les éventuels mutations) sa marche pas et chez ce patients sa ne marche pas pourquoi sa ne marche pas ?
la RT-PCR je l'ai refaite plusieurs fois et l'extraction aussi je pense pas que le problémes est au niveau technique. La technique de RT-PCR que j'utilise est la technique avec les hexaméres, j'utilise le kit d'invitogen le superscript III.

[noun89]

bonjour,
désolé je n'apporte rien en plus dans ce post, maios j'aimerai savoir la signification des initiales RT-PCR et PCR et leur utilité parce que c'est dans mon cours de biologie moléculaire mais je n'ai pas compris et je n'arrive pas a trouver d'infos (compréhensibles) sur ce sujet sur le net.

merci beaucoup d'avance et excusez moi de m'incruster pour demander des infos (ben oui, théoriquement quand on écrit une réponse on apporte son aide et là je le fais pas... alors je suis un peu génée...)

[Yoyo]

Non tous mes segments ne font pas la même taille ils se situent entre 280 et 500pb. J'amplifie 11 segments de mon cDNA ce qui correspond à tout les exons ciblés sur l'ADNg qui code pour la protéine d'intérêt. 11 fois car le séquenceur ne permet pas de lire au dela de 700pb alors on segmente. Le 11 ème segment correspont au 2 derniers exons (extrémité 3').

Tiens justement c'est la région qui est reverse trancrite en premiere!
Il faut savoir que la RT n'est quand meme aps super processive et que RT un grand fragment est tres peu efficace. Qu'elle est la taille de ton ARNm ?

Oui faudrait peut être faire de la PCR Q, mais ici qu'est ce qui explique que quand j'amplifie la même région d'interêt CDNA des autres patients (la région est exactement la même hormis les SNP et les éventuels mutations) sa marche pas et chez ce patients sa ne marche pas pourquoi sa ne marche pas ?

Peut etre que chez tes autres patients l'ARNm est plus stable donc tu en as plus, ce qui fait que la RT marche mieux...

la RT-PCR je l'ai refaite plusieurs fois et l'extraction aussi je pense pas que le problémes est au niveau technique. La technique de RT-PCR que j'utilise est la technique avec les hexaméres, j'utilise le kit d'invitogen le superscript III.

Si c'est un probleme récurrent, alors tu l'auras a chaque fois

bonjour,
désolé je n'apporte rien en plus dans ce post, maios j'aimerai savoir la signification des initiales RT-PCR et PCR et leur utilité parce que c'est dans mon cours de biologie moléculaire mais je n'ai pas compris et je n'arrive pas a trouver d'infos (compréhensibles) sur ce sujet sur le net.

RT-PCR: Reverse-Transcription PCR: ca consiste en une transcription inverse de l'ARNm pour obtenir un ADNc avant de faire de la PCR.
PCR: Polymerase Chain Reaction: ca consiste a amplifier une région spécifique de l'ADN. je te renvoy a ton cours pour plus d'info.

YOyo

[Bacillus 100]

Tiens justement c'est la région qui est reverse trancrite en premiere!
Il faut savoir que la RT n'est quand meme aps super processive et que RT un grand fragment est tres peu efficace. Qu'elle est la taille de ton ARNm ?

Peut etre que chez tes autres patients l'ARNm est plus stable donc tu en as plus, ce qui fait que la RT marche mieux...

Si c'est un probleme récurrent, alors tu l'auras a chaque fois



RT-PCR: Reverse-Transcription PCR: ca consiste en une transcription inverse de l'ARNm pour obtenir un ADNc avant de faire de la PCR.
PCR: Polymerase Chain Reaction: ca consiste a amplifier une région spécifique de l'ADN. je te renvoy a ton cours pour plus d'info.

YOyo

Mon CDNA entier fait environ 6400pb. Trés bien pour l'info je n'exclue pas le défaut de la RT-PCR, je vais directement amplifier l'ADNg. Par contre qu'est ce qui peut expliquer l'instabilité de cet ARN et pas celle des autres patients? cela peut être aléatoire ? cela serait-il lié à la mise en culture des fibroblastes avant l'extraction?

Merci pour ton aide YoYo

[Yoyo]

salut

je ne connais pas ce kit il est peut etre super efficace, mais 6.4Kb en RT ca me parait enorme! moi je me limite a quelques centaines de bases!!!

Sinon si la mutation de ton patient est une microdeletion changeant le cadre de lecture ou un codon stop alors cela va rendre instable l'ARNm (via la voie de degradation appelée NMD). Si en revanche c'est une mutation faux sens ou la deletion d'un exon complet, l'ARN ne sera pas affecté.

Yoyo

[Bacillus 100]

Oui 6,4kb c'est peut être enorme, ce kit je l'ai utilisé plusieurs fois pour la même taille et sa à toujours bien marché, à part cette fois-ci mais faut savoir que ce patient phénotypiquement présente le syndrome typique de la maladie on s'attend donc à un changement au niveau du gène. Je pensais pas qu'une microdeletion et un codon stop pouvait rendre instable l'ARNm .

merci je me sens mieux maintenant! parceque j'ai eu les réponses à toutes mes questions..

[Yoyo]

salut

de rien, ca le rends instable car le changement du cadre de lecture induit par la microdeletion (faut pas que ca soit un multiple de 3!) provoque l'apparition d'un codon stop prématuré (comme une mutation non-sens). Cela provoque alors la degradation de l'ARNm et l'inhibition de la traduction.

YOyo