bruit de fond et cytométrie

[invite0052996b]

bonjour,
Je recherche des renseignements sur le bruit de fond d'un produit. En fait qu'est-ce que le bruit de fond? Si on rapporte cela à un cytomètre, le cytomètre possède t-il un bruit de fond? merci de vos réponses
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[invite6487dc7f]

Salut,
Un bruit de fond ce sont des sortes d'interférences, c'est un résultat positif ou a peu près et qui n'est pas sensé être là et qui va gêner pour la lecture.

Si tu veux un exemple concret en cytométrie, on marque des cellules (par exemple les lymphocytes T dans le sang) avec un fluorochrome (FITC) couplé a un Ac.
Si cet Ac n'est pas très spécifique il peut se fixer sur d'autre cellules que les LT et tes résultats ne seront pas cohérents. Ou alors certaines molécules sont fluorescentes d'elle même (l'hémoglobine je crois) et ca peut aussi faire des bruits de fond.
Voila

[invite0052996b]

d'accord merci. Mais comment fait t-on pour mesurer un bruit de fond?
sinon quelqu'un aurait t-il une bonne connaissance des cytomètres? merci

[invite7981ccce]

bien souvent pour pallier au brut de fond, on peut dans l'exmple donné ci dessus, utiliser un Ac plus spécifique, faire plusieurs rinçage pour éliminer les liaisons de faible affinité, on va augmenter "l'exigence" pour parvenir à diminuer le bruit de fond, et il faut tjs le prendre en considération selon le contexte de ton étude...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0052996b]

merci globalement j'comprends le but. Mais je vois pas comment on peut mesurer ce bruit; il y a une calibration?

[invite7981ccce]

oui il est possible de faire des calibrations

[invite6487dc7f]

Je sais pas si on mesure vraiment le bruit de fond.
Par contre on doit pouvoir faire des témoins pour se rendre compte de leur influence.

[invite0052996b]

Toujours dans le même contexte. Existe t-il des bruits de fond pour des réactifs ou milieux de culture liquide? Si oui, comment le mesurer. On parlait de témoins, alors de quoi serait constitué ces témoins? Connaissez vous le rôle des billes de calibrations dans la calibrations du cytomètre? merci

[invite6487dc7f]

A la question "Existe t-il des bruits de fond pour des réactifs ou milieux de culture liquide?" je dirais oui. comme partout.
Après pour l'histoire des témoins je me suis peut être emballé un peu vite , en histofluorescence je c'est qu'on fait des témoins. Pour la cytométrie je vois pas trop comment on pourrait faire.
On peut mesurer la fluorescence sans le marqueur mais cela ne rendrait pas compte de tous les bruits de fonds.

Sinon j'ai jamais entendu parlé des billes de calibration mais avec un nom pareil...
Comme un cytomètre est capable de mesurer la taille des cellules, j'imagine que des billes de talle connue sont mesurés pour pouvoir calibré l'appareil tout simplement.

[invite0052996b]

merci dèjà pour ces info. Je me renseignerais un peu plus sur ces mesures de bruits de fond en cytométrie.

[sansplomb]

Bonjour,

En effet il existe "un bruit de fond" sur les cytomètres, en particulier, parce que ces machines sont des amplificateurs de lumière.
Les causes sont multiples. Par exemple, les Ac en solution dans l'échantillon.
Il y a également la lumière parasite (les cytomètres sont généralement dans le noir).
La température peut jouer à deux niveaux: sur le PMT (tube photomultiplicateur) par agitation thermique des électrons sont arachés à la cathode et amplifiés et sur les diodes laser en entrainant des fluctuations.
Bref, ce bruit de fond est réellement génant que dans le cas ou tu regardes des événements très peu fluorescents (moins de 200 équivalents molécules de FITC pour les meilleurs cytomètres) ou de petite taille ( de l'ordre de 500 nm).
Les billes de calibrations sont généralement utilisées pour vérifier l'alignement de l'optique (laser, jet, banc optique, pmt). Certains kits utilisent ces billes pour définir une taille (par exemple des kit pour détecter les microparticules), dans ce cas les billes vont de 0.3 à 3 um.

cordialement

[invite0052996b]

merci sansplomb. Mais pourrais tu dévellopper plus l'utilisation des kits dans la détection des particules. Comment ces billes fonctionnent t-elles dans ce cas ?
De même comment ces billes permettent de vérifier l'alignement des composants et donc la bonne calibration du cytomètre (je veux dire par là, comment interprète t-on les résultats donnés par le cyto? lors des résultats donnés lors de la calibration, qu'est ce qui permet de dire qu'il y a un bruit de fond élevé? (dispersions des points,...)) merci

[invite0052996b]

Je n'ai pas non plus compris l'effet des Ac (lié a un manque de spécificité et fixation (non désirée) sur la molécule à doser de l'échantillon ?) en solution dans l'échantillon, sur le bruit de fond.

[sansplomb]

bonjour,

Quand on fait un marquage en cytométrie, on met généralement, un excès d'anticorps. Si tu laves insuffisament, il va rester des anticorps en solution (non fixés aux cellules ou particules) qui vont augmenter le bruit de fond.
Dans ce cas, c'est pas un problème de spécificité mais seulement d'excès (encore une fois ce problème se pose surtout dans le cas d'un marquage de faible intensité).
La fixation non spécifique des Ac est un autre problème, dans ce cas l'Ac se fixe à la cellule (généralement par la partie Fc de l'Ac ou plus rarement par le fluorochrome, c'est le cas des cyanines).
Juste pour info, quand tu fais un marquage en cytométrie, il faut toujours faire un contrôle négatif. Ce contrôle mesure le bruit de fond (fixation non spécifique, excès d'Ac, ect). C'est par rapport à ce contrôle que tu peux dire si un marquage est positif ou non.


Pour les billes d'alignement.

Les billes sont calibrées en taille et en intensité de fluorescence (c'est le cas des calibrite de chez BD ou des autres). On connait les valeurs à atteindre lorsque l'alignement est correct. Toute déviation par rapport aux résultats attendus signifie, généralement, un désalignement du cytomètre (se traduit par une perte des performances comme la sensibilté et ou une augmentation du bruit de fond).
les billes des kits fonctionnent sur le même principe, elles permettent de regler le cytomètre pour être sur que l'on observe les microparticules.

Juste un point pour finir. Il y a deux origines au bruit de fond.

Le premier a pour origine la machine en elle même (PMT, laser, qualité du liquide gaine ect), ce bruit de fond est tres faible. Il devient un problème lorsque tu es aux limites de détection du cytomètre et il est pas facile d'avoir une action dessus voir impossible.

La seconde est due aux cellules ou particules que tu passes sur le cytomètre. Dans ce cas, il y a de nombreuses possibiltés comme la cellule elle même (un lymphocyte donne beaucoup moins de bruit de fond qu'une cellule dendritique), on peut citer aussi l'exces d'Ac ou une fixation non spécifique de l'Ac sur la cellule. Contrairement au bruit de fond de la machine, on peut essayer de diminuer celui ci en lavant plus ou en utilisant des produits comme le Fc block pour diminuer la fixation non spécifique des Ac.

Cordialement

[invite0052996b]

merci sansplomb pour ces indications, ça m'aide beaucoup. Si j'ai d'autres questions sur le cytomètre je saurais qui contacter...

[invite8c161d56]

bin c une question tré importante mais je m'éxcuse vrm j'ai pas une réponse a cette question.. mais est ce que vous pouvez m'aider a trouver un théme de fin d'étude ( ingénieur en biotechnologie) réalisable et sera dans la domaine médicale ? par éxemple sur les hormones de la glande thyroide j'attends vos réponse svp....merci