Bonjour, je suis à la recherche de connaisseurs en terme de transfection et transduction. J'ai des notions pour la transfection (utilisant des retrovirus pour infecter des cellules afin d'exprimer de façon stable un gène) et la transduction (utilisant des virus, cosmides) pour une expression temporaire.
Si quelqu'un connait un document complet pour ces deux sujets, ce serait sympa de me dire comment mettre la main dessus
Merci
C'est une question interéssante et j'avoue que je ne suis pas sûre de moi mais je n'avais pas la même idée que toi, pour moi la différence ne réside pas dans une expression stable ou prolongée. Pour moi, la transfection c'est utiliser des méthodes chimiques ou physiques pour introduire ton plasmide, comme des liposomes, ce qui n'empêche pas de distinguer une transfection stable et transitoire. De même que pour moi la transduction c'est utiliser un vecteur viral pour introduire ton ADN exogène, et là, de même, en fonction du type de virus, l'ADN va être intégré au génôme (retrovirus par ex) ou pas (adenovirus par ex). Si quelqu'un peut nous donner son avis, ça m'interesse!
ca me semble tout à fait correct comme réponse et en accord avec ce que j'ai pu lire... Même si je n'arrivais pas à faire réellement la différence entre les deux. Mais c'est vrai qu'en regardant du coté technique (chimique ou biologique) plutôt que résultats (effet définitif ou transitoire) on peut comprendre les 2 termes employés...
Un troisième avis ?
T
Salut,
Je suis d'accord avec Delphinette. Après, la méthode à utiliser dépend de ce que tu veux faire. Si c'est pour une expression transitoire, il est beaucoup plus simple d'utiliser un liposome, car même avec un taux de transfection très faible, tu peux voir ta protéine exogène facilement en western-blot. Par contre, si tu veux faire des stables et si tu as tous les outils, utiliser un vecteur viral est plus rapide/moins aléatoire que d'utiliser un agent transfectant... Tout ça est bien évidemment dépendant de ce que tu veux obtenir à la fin.
FX
Salut Fxmulder, merci pour ton avis... Qu'est-ce que tu entends par "utiliser un vecteur viral est plus rapide/mons aléatoire que d'utiliser un agent transfectant" ? Pourtant, tous les kits lipofectamine et autres utilisent ce genre de matériel pour avoir des transfections quellles que soientt les cellules en face, non ? D'ailleurs les cultures cellulaires que j'ai (expression permanente d'un canal) sont stables et ont été faites avec justement la lipofectamine... Y'a t'il possibilité que les canaux disparaissent avec les cycles ?
Tu peux faire une lignée stable avec la lipofectamine, c'est juste que le taux de cellules transfectée est faible, et le taux de cellules ayant intégré l'ADN encore plus faible!.... D'où le "moins rapide/moins efficace". Car avec un vecteur viral, tu auras beaucoup plus de cellules transduites et si c'est un vecteur intégratif, tes cellules qui auront été transduites vont intégrer efficacement cet ADN, ce qui n'est pas le cas avec la lipofectamine qui ne pemret pas d'intégrer l'ADN. Mais on ne peut pas toujours travailler avec du vecteur viral, tous les laboratoires ne sont pas faits pour! Je suppose que c'est la raison pour laquelle en général on essaie d'abord avec la lipofectamine si les installations ne nous permettent pas de travailler avec du vecteur viral...
J'aurais du coup une autre question : la lipofectamine permettant juste l'entrée, il faut que le plasmide en question puisse "s'intégrer" dans l'ADN de la cellule si on veut une expression permanante. Je sais que la lignée que j'ai, exprimant un canal dans le plasmide pCIneo (promega), exprime de façon permanente cette molécule. Cependant sur le manuel de Promega il est dit que ce plasmide peut exprimé la protéine d'interet (que l'on aura eu soin d'intégrer) de manière transitoire ou permanente... Si c'est la séquence du plasmide qui permet ou pas son intégration dans l'ADN de la cellule, comment obtenir ces 2 sortes d'expression (transitoire/permanent) ? Quel facteur supplémentaire entre en jeu ??
Merci pour cet éclairage...
E
salut
l'expression transitoire est due au fait que le plasmide exprime la proteine mais comme ce plasmide ne se replique pas il est perdu au cours des divisions cellulaires.
Les cellules font aussi des recombinaisons heterologues. Pour les selectionner, on utilise generalement de la puromycine (le vecteur possede le gene de resistance). Alors seules les cellules qui auront intégré aleatoirement ce plasmide dans leur chromosome pourront survivre. On obtient donc des lignées stables.
Yoyo
Et si je peux rajouter, en fait, une transfection en stable est une transfection transitoire très raccourcie (ou le plasmide n'a pas eu le "temps" de s'intégrer). Quand tu veux regarder l'expression en transitoire, tu regardes généralement 24h-48h après la transfection, pour les stables, le temps d'établir la lignée, tu en as pour 1-2 mois.
Ok Yoyo, si je comprends bien contrairement à la transfection par virus (j'ai retenu les séquences LTR de part et d'autre du gène pour son insertion dans l'ADN), ici (transduction d'un gène avec lipofectamine) on introduit un gène qui à de grandes chances de disparaitre avec la réplication de la cellule et on croise les doigts pour que quelques unes (ou une !) cellule(s) fasse une recombinaison hétérologue (donc integre le gène dans son ADN) et qu'on la sélectionne grâce à la resistance associée au gène en question... Du coup, plus il y a de cellules, plus on aura de chance de choper celle qui fait la recombinaison qui nous interesse... ? En gros, les kit de transduction permettent juste d'apporter le matériel dans la cellule et d'attendre qu'une petite erreur se passe lors du cycle, hein ?
