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Chromatographie d'exclusion

  1. mortabit

    Date d'inscription
    septembre 2007
    Messages
    48

    Unhappy Chromatographie d'exclusion

    Bonjour,

    je veux m adresser aux personnes qui ont déja fait de la chromatographie d exclusion.
    je ne demande ni protocole ni determination du principe mais je demande comment manipuler car je n ai jamais fait de chromatographie d exclusion.

    Si qlq un peut m aider en m expliquant avec trop de détails commnet préparer la colonne, le gel, comment déposer, comment monter le dispositif, ...
    tous les détails techniques ...Tout ce qui vous parretera simplebanale peut etre pr moi sera trés interessant...


    Je vous remercie d avance pour votre aide

    -----

     


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  2. Mrikzik

    Date d'inscription
    janvier 2008
    Localisation
    Dijon
    Âge
    30
    Messages
    420

    Re : chromtaographie d exclusion

    Salut
    Je ne sais pas comment on fait le gel en lui même, il est possible qu'il soit déja tout prêt acheté (j'en sais rien en fait).
    Pour préparer la colonne il faut mettre un bout de coton hydrophile ni trop gros ni trop petit (environ 1cm cube pour une colonne de 25 cm) le but est de laisser passer le tampon mais pas le gel.
    Ensuite tu agite ton gel (qui doit être dans un tampon) pour le mettre en suspension (car il se dépose au fond) puis tu le verse dans la colonne.
    Le gel doit environs atteindre les 2/3 ou 3/4 de la colonne.

    Pour le dépôt tu ouvre le robinet jusqu'à ce que le tampon au niveau du gel (celui-ci doit être plat à sa surface).
    Tu dépose le plus doucement possible goutte par goutte ton essai, ou tu le dépose contre la paroi de la colonne (le but est de garder la surface plate).
    Ensuite tu fait pénétrer le volume d'essai dans le gel en ouvrant le robinet.
    Après tu remet du tampon sans remuer le gel (donc de la même façon soit en faisant couler sur la paroi soit goutte à goutte).
    Tu fait migrer en rajoutant du tampon pour que ton gel ne soit jamais a sec.
    Et tu récupère dans des tubes.
    Le mieux c'est quand même qu'on te montre directement sur une colonne.
    Des questions?
     

  3. mortabit

    Date d'inscription
    septembre 2007
    Messages
    48

    Re : chromtaographie d exclusion

    donc quand je veux déposer mon essai ,le robinet doit etre ouvert ou fermé?
    en général qd fermer et qd ouvrir le robinet de la colonne?

    par expl si je depose 2 ml de mon essai goutte à goutte, combien je dois verser aprés de tapom.?

    je te remercie infiniment
     

  4. Mrikzik

    Date d'inscription
    janvier 2008
    Localisation
    Dijon
    Âge
    30
    Messages
    420

    Re : chromtaographie d exclusion

    Citation Envoyé par mortabit Voir le message
    donc quand je veux déposer mon essai ,le robinet doit etre ouvert ou fermé?
    en général qd fermer et qd ouvrir le robinet de la colonne?

    par expl si je depose 2 ml de mon essai goutte à goutte, combien je dois verser aprés de tapom.?

    je te remercie infiniment
    Quand tu dépose ton robinet est fermé, c'est le moment le plus délicat de la manipulation, il peut être relativement long (30s ou 1min) donc si ton robinet est ouvert le niveau de tampon descend.(pas très pratique sachant que ton gel ne doit pas être a l'air).

    Tout dépend de ta colonne mais 2 ml pour un dépot c'est énorme, attend toi plutot a 0,1ml.

    Le tampon alimente en permanence la colonne, il n'y a pas de volume donné.
    Tant que la migration n'est pas fini tu dois avoir du tampon au dessu de ton gel.
    Conseil : le gel c'est des petit billes, elle coulent mais au moindre mouvement de l'eau elles bougerons. Donc pour éviter ça au maximum pendant la migration (après le dépos) met 3 ou 4 cm de tampon en réserve au dessus du gel. Comme ça quand tu en rajoutera ça brassera moins le gel que si le niveau de tampon est a raz (tu me suis???).

    Pour résumer tu ouvre le robinet pour faire descendre le niveau du tampon a raz le gel quand tu va faire ton dépôt et quand tu fait ta migration

    Qu'es ce que tu sépare? des protéines?
     

  5. mortabit

    Date d'inscription
    septembre 2007
    Messages
    48

    Re : chromtaographie d exclusion

    Citation Envoyé par Mrikzik Voir le message
    Quand tu dépose ton robinet est fermé, c'est le moment le plus délicat de la manipulation, il peut être relativement long (30s ou 1min) donc si ton robinet est ouvert le niveau de tampon descend.(pas très pratique sachant que ton gel ne doit pas être a l'air).

    Tout dépend de ta colonne mais 2 ml pour un dépot c'est énorme, attend toi plutot a 0,1ml.

    Le tampon alimente en permanence la colonne, il n'y a pas de volume donné.
    Tant que la migration n'est pas fini tu dois avoir du tampon au dessu de ton gel.
    Conseil : le gel c'est des petit billes, elle coulent mais au moindre mouvement de l'eau elles bougerons. Donc pour éviter ça au maximum pendant la migration (après le dépos) met 3 ou 4 cm de tampon en réserve au dessus du gel. Comme ça quand tu en rajoutera ça brassera moins le gel que si le niveau de tampon est a raz (tu me suis???).

    Pour résumer tu ouvre le robinet pour faire descendre le niveau du tampon a raz le gel quand tu va faire ton dépôt et quand tu fait ta migration

    Qu'es ce que tu sépare? des protéines?

    oui je sépare des protéines.
    mon essaie est d environ 5 ou 6 ml, j envisage récuperer des volume de 0,5 ml, t en penses quoi?
    Merci pour les efforts que tu fournis, je te suis reconnaissante.
    donc le tampon comme tu as dis , il alimente en permanence le gel, comment pourrais je regler le débit?

    merci encore
     


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  6. Mrikzik

    Date d'inscription
    janvier 2008
    Localisation
    Dijon
    Âge
    30
    Messages
    420

    Re : chromtaographie d exclusion

    Citation Envoyé par mortabit Voir le message
    oui je sépare des protéines.
    mon essaie est d environ 5 ou 6 ml, j envisage récuperer des volume de 0,5 ml, t en penses quoi?
    Merci pour les efforts que tu fournis, je te suis reconnaissante.
    donc le tampon comme tu as dis , il alimente en permanence le gel, comment pourrais je regler le débit?

    merci encore
    Donne moi plus de précision sur ta manip. Ton essai de 5 ou 6ml est donné au départ ou tu la décidé par toi même? Pareil pour le volume que tu récupère.
    Comment compte tu détecter les protéines dans l'élua?Tu a un spectro raccordé? Quels sont les protéines que tu sépare (masse moleculaire)? Le domaine de séparation de ton gel?
    T'as manip est faite dans quel but? Tu fais de la qualité ou de la quantité?
    Comme ça ça me parait vraiment difficile. Tu a une dilution obligatoire pour une telle manip, étant donné que tu "pousse" l'essai avec du tampon tu va normalement et sauf erreur de ma part récupérer un volume supérieur d'élua.
    Donc récupérer 0,5 ml à partir de 5 ça me parait difficile.

    Tu as un robinet en bas de la colonne. c'est comme ça que tu règle le débit.
    Tien si tu veux voir a quoi ça ressemble.
    http://images.google.fr/imgres?imgur...FR252%26sa%3DN
    (l'adresse de fou!!lol)

    Dernière question, quel est ton niveau? bac, BTS,..?
     


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