Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

[invite04f90b8c]

Bonjour à tous,

j'ai un souci sur une annale !
On nous dit qu'on prend une protéine P, on lui fait subir soit une phosphorylation, soit une acétylation soit les 2 et ils demandent l'effet que ça aura sur une electrophorèse, c'est à dire si une fois phosphorylée la protéine modifiée migrera plus vers l'électrode - ou + par rapport à la protéine P intacte.

Bon pour la phosphorylation, on ajoute 2 charges - à la protéine ça va carrément plus migrer vers le + ! Mais pour l'acétylation ?? On ajoute aucune charge finalement donc je pense que ça reste au même niveau que la protéine P intacte mais je suis pas sure ! Car on ajoute quand même un oxygène, donc il pourrait être plutot attiré vers le + lui aussi non ?

Merci de m'éclairer un peu je fatigue là
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[Zellus]

Salut !!

L'acétylation est l'ajout d'un groupement CH₃CO- au niveau des chaînes latérales de lysines ou de l'extrémité N-terminale d'une protéine. La charge positive de l'amine modifiée va alors disparaître donc je te laisse conclure ...

[invite04f90b8c]

Alors que la protéine P toute seule étaient attirés vers l'électrode - la protéine P acétylée ne va pas bouger ! Merci

[Zellus]

la protéine P acétylée ne va pas bouger

Heu non tu peux pas dire ça parce qu'il peut y avoir d'autres acides aminés chargés dans ta protéine (histidines, arginines, glutamates, aspartates). Disons plutôt qu'elle va moins migrer vers la cathode que ta protéine P normale.

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

Il y a la théorie mais après il y a la pratique. Moi sur mes Western, quand je regarde ma protéine, j'ai deux bandes : une qui est la forme "normale", une autre très légèrement au-dessus qui est la forme hyperphosphorylée....La phosphorylation retarde la migration électrophorétique, c'est illogique car, comme tu l'as dit, le phosphate apporte deux charges négatives. Mais n'y a-t-il pas quelques cations divalents qui pourrait complètement inverser la charge, annulant les charges négatives des phosphates mais en plus apportant une charge positive..?

Greg

[gorben]

Salut,

Il y a la théorie mais après il y a la pratique. Moi sur mes Western, quand je regarde ma protéine, j'ai deux bandes : une qui est la forme "normale", une autre très légèrement au-dessus qui est la forme hyperphosphorylée....La phosphorylation retarde la migration électrophorétique, c'est illogique car, comme tu l'as dit, le phosphate apporte deux charges négatives. Mais n'y a-t-il pas quelques cations divalents qui pourrait complètement inverser la charge, annulant les charges négatives des phosphates mais en plus apportant une charge positive..?

J'imagine que le probleme ici ne concerne que les gels natifs. En Western la charge nette de la proteine est masquee par le SDS, donc 1 ou 2 charges de plus ca ne change absolument rien.
Dans ton cas c'est surtout que les phosphates vont "alourdir" la proteine, elle migrera donc moins vite.

A+

[LXR]

Ma protéine fais 220 kDa (BRCA1) et pour arriver à avoir un shift suffisant pour être visible à des poids moléculaires pareils, il faut au minimum un écart de poids moléculaire d'1 kDa et encore. Un phosphate faisant grosso modo 80 g.mol-1...il faudrait une bonne quinzaine de phosphate sur les protéines hyperphsophorylées pour dépasser légèrement 1 kDa. C'est possible mais ça fait une sacrée phosphorylation. Mais je suis d'accord avec toi que le SDS recouvre la protéine (je n'y ai plus pensé à ça...) donc mon hypothèse est un peu foireuse, la tienne étant la plus probable. En plus sur 1863 acides aminés, c'est possible, les phosphorylations de cette protéine démontrées actuellement étant déjà une bonne dizaine, sans compter celles qui restent sans doute à découvrir....on s'approche donc de la quinzaine nécessaire au shift...comme quoi je réfléchis pas encore assez à mon sujet.. Merci.

Greg

EDIT : je suis carrément hors-sujet car, en effet, c'est forcément en natif vu qu'en gel dénaturant le SDS rend négligeable toute charge, la taille restant le seul paramètre discriminatoire. Désolé pour cet aparté.

[Vinc]

Dans ton cas c'est surtout que les phosphates vont "alourdir" la proteine, elle migrera donc moins vite.

Non en fait ce n'est pas une question de masse. La masse d'un phosphate est complètement négligeable devant celle de la protéine.
Le shift de phosphorylation est du à l'encombrement stérique du phosphate qui perturbe et retarde la migration de la protéine modifiée, dans le gel.

V.

[LXR]

Bizarrement cette explication me convient mieux, mais je la trouve encore un peu approximative... Le phosphate, malgré sa taille imposante doit pouvoir être comparable à une chaine latérale encombrante comme la lysine par exemple. Dans ce cas, la migration électrophorétique tiendrait compte aussi de la composition en acide aminé et, pour un même poids moléculaire, une protéine ayant une composition forte en acide aminés à chaîne latérale encombrante migrerait moins vite qu'une protéine à composition forte en acides aminés à chaine latérale peu encombrante...et je ne pense pas que ce soit le cas. Donc je garde tout de même cette explication du shift forme non phosphorylée vs forme hyperphosphorylée, mais je suis pas totalement convaincu...A quand la cristallographie sur les protéines recouvertes de SDS?

Greg

[MaliciaR]

A quand la cristallographie sur les protéines recouvertes de SDS?

Greg

Déjà, faudrait-il que l'on ait les structures cristallines des protéines natives qui nous intéressent... Ce qui n'est pas si souvent le cas... (Bon, ça me donne du boulot, tu me diras, j'en ai deux à amener à la cristallo si tout baigne ).


Cordialement,

[Vinc]

Non pas du tout!
La protéine est linéaire à cause du SDS, peu importe la composition en acides aminés. Mais le phosphate fait office de "chaine latérale sur la protéine" si tu me permets l'expression.

V.

[Yoyo]

Salut

Je confirme ce que dis vincent, le shift est lié à l'encombrement stérique du phosphate pas a sa charge!! c'est pareil avec toutes les autres modifications post-traductionnelles.

D'ailleurs j'en profite, pour une question a LXR qui bosse avec une grosse protéine, on travaille sur une protéine de 312KDa mais on a bcp de mal a la voir en western, est-ce qu'il y a des astuces de protocole quand on bosse avec des protéines de cette taille la?

YOyo

[LXR]

Oui je prends la concentration en polyacrylamide quasiment la plus basse, c'est à dire des gels à 6%. Dans mon labo il y a une équipe qui travaille sur une protéine qui fait aux alentours de 500 kDa (mais ils l'ont appelé p400 pour pas trop choquer ). Eux par contre ils commandent des gels à gradient d'acrylamide. Je crois que ça démarre à 2-3% en polyacrylamide et ça finit à 8 ou 10% car ils regardent en parallèle une protéine de 60 kDa . Ca peut être une solution intéressante. Dans ton cas je pense que 6% ce sera trop juste car j'ai une forme qui est presque à 250 kDa et elle est à 1 cm du stacking. 4% ça devrait passer peut-être, donc même concentration en polyacrylamide que le stacking.

Greg

[Yoyo]

salut

merci et en dehors de la concentration en polyacrylamide il y a d'autres precautions a prendre?

Yoyo

[LXR]

Non pas à ma connaissance. Pour mes protéines après migration à 80V dans le stacking et 130V dans le separating, je transfère en liquide pendant 1h30 à intensité fixe 350 mA, puis les autres étapes sont inchangées par rapport à d'autres westerns sur d'autres protéines. L'étape la plus spécifique est la préparation du gel, dans mon cas.

Greg

[gorben]

Salut,
\

salut

merci et en dehors de la concentration en polyacrylamide il y a d'autres precautions a prendre?

Yoyo

Oui tu dois preparer tes prot avec un inhibiteur de phosphatase (genre orthovanadate)...

A+

[gorben]

J'ai oublie, il y a aussi des Ac qui reconnaissent specifiquement les Tyr-P.

A+

[Vinc]

Salut!

Oui tu dois preparer tes prot avec un inhibiteur de phosphatase (genre orthovanadate)...

Je ne vois pas ce que va apporter un inhibiteur de phosphatase pour visualiser une protéine de haut poids moléculaire^^

J'ai oublie, il y a aussi des Ac qui reconnaissent specifiquement les Tyr-P

Là encore je ne vois pas le rapport avec la taille de la protéine, et c'est valable ausi pour les serines ou les thréonines phosphorylées, les ubiquitines, les sumoylation etc... (vu qu'on parle de modifs post-traductionelles).

V.

[LXR]

Je pense que Gorben a cru que Yoyo voulait voir l'état phosphorylé d'une protéine.

Greg

[gorben]

oups autant pour moi, je pensais qu'il voulait separer la forme phosphorylee et non phosphorylee

Juste pour une grosse proteine, nous on utilise des gels precoules 4-12%. En migrant avec du tampon MOPS. Apres une heure de migration, mes proteines a 250 kD sont environ a 2 cm des puits (le gel fait 7 cm...) donc c'est tres bien.

A+

[Zellus]

Bonjour,

Non en fait ce n'est pas une question de masse. La masse d'un phosphate est complètement négligeable devant celle de la protéine.
Le shift de phosphorylation est du à l'encombrement stérique du phosphate qui perturbe et retarde la migration de la protéine modifiée, dans le gel.

Je dois dire que j'ai assez de mal avec cette idée. Je serais plus pour celle de gorben parce que vu que la protéine est linéaire je pense pas que ça rajoute beaucoup d'encombrement, surtout à une protéine comme celle de LXR qui possède 1863 acides aminés. Mais bon c'est que mon avis ...

Cordialement,
Zellus

[LXR]

Oui mais ça reste toujours une question de taille et non de masse, la masse découlant de la taille de la protéine. Le critère permettant la séparation des protéines est la taille, plus exactement comme disent les biophysiciens le volume hydrodynamique de la protéine qui va déterminer sa vitesse de migration au travers des mailles du gel. J'ai un peu de mal moi aussi avec l'idée que les phosphates dépassent suffisamment des chaines latérales des acides aminés pour avoir plus d'influence sur la migration de la protéine que les chaines latérales elles-même. Mais bon, je ne vois pas d'autres explications non plus...

Greg

[Yoyo]

Salut

Merci pour vos reponses, et dans la foulé un transfert d'une aussi grosse protéine ne pose aucun probleme???

YOyo

[Vinc]

Salut!
Moi je serai toi je transfererai longtemps (quite à mettre deux membranes supperposées si tu veux aussi voir des protéines plus petites qui risques de passer à travers la première). Et j'utiliserai éventuellement une membrane avec une taille de pores plus importante (que le 0,2µ classique)....

V.

[gorben]

Salut,

Perso j'utilise un marqueur de PM colore ca aide en rien le transfert, mais comme ca tu sais immediatement si les proteines de haut PM ont ete transfere ou pas (pas besoin de se faire un western dans le vide).
Pour le transfert, je fais 1h30-2 heures a 35V et les proteines a 300 kD sont sur ma membrane.

A+

[Vinc]

Salut!

Perso j'utilise un marqueur de PM colore ca aide en rien le transfert, mais comme ca tu sais immediatement si les proteines de haut PM ont ete transfere ou pas (pas besoin de se faire un western dans le vide).

En fait non parce que le marqueur transfère en partie (pour pas dire essentiellement) par difusion...

V.

[LXR]

Euh, sur la question de mettre deux membranes superposées, nous on utilise des membranes de nitrocellulose de porosité 0,45 µm en transférant pendant 1h30 à 350 mA et je regarde BRCA1 à 220 kDa certes, mais aussi comme témoin de dépôt l'HSP60 qui fait environ 60 kDa, et le signal est très fort pour cette dernière. C'est sûr que c'est assez surprenant qu'elle ne passe pas au travers, il faudrait connaitre pour ça la densité des pores de la membrane, mais je pense qu'ils sont suffisamment séparés pour ne pas tout laisser passer, c'est quand même le but. Les pores ne sont là que pour permettre le flux électrolytique. D'ailleurs, avec ce diamètre de porosité, même une protéine de 500 kDa passe au travers de ce genre de pore .

Greg

[Yoyo]

merci a tous pour vos réponses.

YOyo

[Vinc]

Euh, sur la question de mettre deux membranes superposées, nous on utilise des membranes de nitrocellulose de porosité 0,45 µm en transférant pendant 1h30 à 350 mA et je regarde BRCA1 à 220 kDa certes, mais aussi comme témoin de dépôt l'HSP60 qui fait environ 60 kDa, et le signal est très fort pour cette dernière. C'est sûr que c'est assez surprenant qu'elle ne passe pas au travers, il faudrait connaitre pour ça la densité des pores de la membrane, mais je pense qu'ils sont suffisamment séparés pour ne pas tout laisser passer, c'est quand même le but. Les pores ne sont là que pour permettre le flux électrolytique.

Non.
Tu as une partie de ta protéine de 60kDa qui reste sur ta membrane mais si tu mets une deuxième membrane derrière et que tu fais ton western tu verras qu'il y en a autant sur la deuxième, sinon plus^^

V.

[LXR]

ok, je te fais confiance. Mais j'aimerais tout de même savoir quelle est la densité des pores sur ces membranes de nitrocellulose, je ne sais pas où on peut trouver ce genre d'information.

Greg