Encore de la Q-PCR : quantification absolue maintenant

[invite02cefc91]

BOnjour à tous !

Me voilà de retour avec mes questions sur la Q-PCR

J'ai commencé à tester l'efficacité de mes primers, jusque là tout va bien (croisons les doigts).

Ma question aujourd'hui est la suivante : je souhaiterais faire une quantification absolue de mon transcrits d'intérêt pour cela j'ai compris qu'on utilisait la gamme de dilution et les Ct mais j'arrive pas à voir comment on peut revenir à une quantification de transcrits puisque pour la gamme on ne connait que la quantité total d'ARN et pas celle du transcrit ?

Merci pour vos aides


Bonne journée
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[invite7577fe65]

Bonjour Malesore,

Je ne veux pas dire de bêtises, mais la gamme dans une Q-PCR doit être faite avec de l'ADN et non à partir d'ARN passé en RT.

Pour mes réalisations de Q-RT-PCR, ma gamme je la réalise avec un palsmide dont je connais la taille, la concentration... et bien sur dont je possède un couple de primers permettant d'amplifier un fragment de moins de 200pb de ce plasmide.
A partir de là je fais une gamme dans laquelle je connais le nombre de copies de mon plasmide dans chaque tube. (100.000.000 copies, 10.000.000 copies, etc jusqu'à 1 copie)

J'espère pouvoir t'éclairer.
Mides.

[invite02cefc91]

oui je parle d'ARN mais oui c'est de l'ADN mais je résonne à partir de ma concentration initiale d'ARN tot avant ma RT.

Mais je vois pas comment je peux connaitre dans ma gamme la quantité de mon transcript, je peux juste connaitre la quantité d'ARN tot .....