Dilution d'ADN "contaminante"?

[LaurianeR]

Bonjour,

J'ai quantifié des ADN au spectrophotomètre mais, étant un peu visqueux (trop concentrés) la mesure a été un peu faussée. Je décide donc de diluer mes ADN au 1/10 avec de l'eau milliQ (ultrapure).
Là, mes quantifications sont correctes (double mesure cohérente), mais mes rapports de pureté 260nm/280nm diminuent...
Mes ADN dilués seraient donc contaminés (206/280 = 1.65) et pas mes solutions mères d'ADN (260/280 = 1.79)

Quelqu'un saurait-il d'où cela peut venir??

Merci d'avance pour vos réponses!
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[jmbowie]

Bonjour,

J'ai quantifié des ADN au spectrophotomètre mais, étant un peu visqueux (trop concentrés) la mesure a été un peu faussée. Je décide donc de diluer mes ADN au 1/10 avec de l'eau milliQ (ultrapure).
Là, mes quantifications sont correctes (double mesure cohérente), mais mes rapports de pureté 260nm/280nm diminuent...
Mes ADN dilués seraient donc contaminés (206/280 = 1.65) et pas mes solutions mères d'ADN (260/280 = 1.79)

Quelqu'un saurait-il d'où cela peut venir??

Merci d'avance pour vos réponses!

Tu as fais une seule mesure de chaque dilution? La différence n'est pas forcément significative

[MaliciaR]

Ce que je ne comprends pas c'est comment tu peux estimer que tes solutions diluées sont contaminées en comparaison avec tes solutions mère alors que tu dis toi-même que les mesures au niveau des solutions non diluées sont biaisées...


Cordialement,

[Zellus]

Salut,

+1 pour Malicia
Sinon, au labo, pour avoir une meilleure estimation de la concentration d'ADN, on mesure l'absorbance également à 320 nm. A cette longueur d'onde l'ADN n'absorbe pas donc la valeur devrait être nulle. On fait donc la soustraction A₂₆₀-A₃₂₀ pour obtenir la "vraie" absorbance à 260 nm.
Je ne sais pas si tu as fait ça mais ta différence peut venir de là.
J'espère avoir été clair .

Cordialement,
Zellus

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

Merci, Zellus

Autre chose : pour que ton ADN dilué soit contaminé comme tu le supposes, il faudrait que ta MilliQ soit contaminée par un truc qui absorbe à 260 nm Ca fait un peu trop de particularités là...


Cordialement,

P.S. Au fait, je suis plutôt curieuse de savoir quelle technique tu utilises pour obtenir une telle quantité d'ADN que ta solution en soit visqueuse...!

[IngDr]

Pour la contamination de l'eau milliQ, normalement le blanc se fait sur cette même eau, donc s'il y a un contaminant dedans, de toute facon il n'est pas pris en compte.
Plutot que de nous donner le rapport 260/280 donne nous les valeurs @ 260 et 280 nm dans les 2 cas, histoire que l'on sache d'ou vient le pb, : si ton rapport diminue, c'est soit le 260 qui augmente ou le 280 qui diminue.

Pour MaliciaR : ADN visqueux = culot après précipitation à l'Ethanol mal resuspendu, ou présence d'ADN génomique (volontaire ou non !). Pour aider, il est possible d'incuber @ 50°C pendant 10min pour aider à la resuspension. Dans le cas d'ADN génomique, on peut soniquer (tout dépend des applications que l'on veut faire après, mais 10-30s suffit largement)

[Zellus]

Re,
pardon j'ai oublié de dire que les protéines n'absorbent pas non plus à 320 nm donc tu calcules aussi A₂₈₀-A₃₂₀ et tu peux ainsi calculer le rapport A₂₆₀/A₂₈₀.

[LaurianeR]

Bonjour!
Je vais répondre un peu à tout vos messages

Ce que je ne comprends pas c'est comment tu peux estimer que tes solutions diluées sont contaminées en comparaison avec tes solutions mère alors que tu dis toi-même que les mesures au niveau des solutions non diluées sont biaisées...

C'est vrai, mais les rapports 260/280 sont très peu affectés (variation de 0.01 entre mes 2 rapports A₂₆₀/A₂₈₀) alors que les concentrations bougent de 408ng/µl à 550 ng/µl entre mes 2 mesures pour un même ADN...

On fait donc la soustraction A260-A320 pour obtenir la "vraie" absorbance à 260 nm.
Je ne sais pas si tu as fait ça mais ta différence peut venir de là.

pardon j'ai oublié de dire que les protéines n'absorbent pas non plus à 320 nm donc tu calcules aussi A280-A320 et tu peux ainsi calculer le rapport A260/A280.

Je ne l'avais pas fait, mais après soustractions et redivisions, c'est un peu mieux pour les rapports (A260-A320)/(A280-A320). Mais les différences sont toujours à peu près les mêmes...
Merci quand même pour l'info

Autre chose : pour que ton ADN dilué soit contaminé comme tu le supposes, il faudrait que ta MilliQ soit contaminée par un truc qui absorbe à 260 nm Ça fait un peu trop de particularités là...

Cordialement,

P.S. Au fait, je suis plutôt curieuse de savoir quelle technique tu utilises pour obtenir une telle quantité d'ADN que ta solution en soit visqueuse...!

J'avais, comme toi, émis l'hypothèse de l'eau que j'ai très vite abandonnée vu que c'est avec elle que j'ai fait mon blanc.
Sinon, j'ai extrait mes ADN à partir de tissus animaux lysés 3h à 55° au bain-marie, puis phénol/chloroforme avec des tubes contenant un gel bloquant la phase P/chlo (très pratique) et Éthanol précipitation avant de reprendre mon culot dans de l'eau.

Avec ces nouvelles infos, avez-vous une idée du pourquoi les rapport baisent avec la dilution?

[piwi]

A mon avis la différence est bêtement non significative. Ca ne vaut pas la peine de se faire suer plus que cela pour votre petite variation.

[IngDr]

A mon avis la différence est bêtement non significative. Ca ne vaut pas la peine de se faire suer plus que cela pour votre petite variation.

Tout à fait d'acc, exactement pour ca que je veux voir les valeurs de DO.