Enzyme de restriction

[brunop]

Bonjour,
Ci dessous un exo pour le lequel je bloque à partir de la deuxième question car les autres en déoulent :

Ennoncé :
Les enzymes de restriction Bam HI et Pst I clivent respectivement les séquences suivantes : 5' G-GATCC 3' et 5' CTGCA-G 3' (- indique le lieu de coupure).
1- Indiquer les extrémités 5' et 3' des molécules d'ADN clivées.
2- Comment les extrémités seraient-elles modifiées si les molécules clivées étaient incubées en présence d'une ADN polymérase et des 4 dNTPs ?
3- Aprés la réaction de la question 2, pourrait-on toujours joindre les extrémités Bam HI par incubation avec l'ADN ligase de T4 ? Pourrait-on joindre les extrémités Pst I ? (L'ADN ligase de T4 peut joindre aussi bien des extrémités franches que des extrémités cohésives).
4- La jonction des extrémités (question 3) restaurera t-elle le site Bam HI ? Restaurera t'elle le site Pst I ?

Mes réponses :
1- Pour cette question je pense avoir compris :
Séquense Bam HI Extremité 5' : G Extrémité 3' : GATCC
Séquence Pst I Extrémité 5' : CTGCA Extrémité 3' : G

2 -
Pour cette question j'ai répondu qu'il ne se passait rien, car il n'y a pas d'amorce.
3 -
Je ne peux non plus répondre sachant que rien ne s'est produit pour la question 2
4 -
N'ayant pas de réponse pour 3 je ne peux répondre à 4.

En fait tout mon soucis est lié au fait que l'on ne nous indique pas la présence de l'amorce, et que donc la polymérisation ne peut avoir lieu.

Merci pour l'aide.
-----

[Yoyo]

Salut,

Pour la question I :
BamHI le site de coupure deviens apres action de l'enzyme:
5'-------G3' 5'GATCC-------3'
3'-------CCTAG5' 3'G-------5'

Pour PstI:
5'-------CTGCA3' 5'G-------3'
3'-------G5' 3'ACGTC-------5'

On dit que BamHI crée des extrémités 5' sortantes, alors que PstI crée des extrémités 5' rentrantes.

Je te laisse conclure pour savoir si ta réponse 1 etait exacte ou non.

Question 2:
Ta réponse n'est pas bonne. L'amorce est le 3'OH crée par la coupure, l'ADN pol va pouvoir recopier les quelques nucléotides qui "sortent". MAIS l'ADN pol n'est capable de synthétiser l'ADN QUE de 3'->5'. Autrement dit elle ne peut amorcer la réaction qu'a partir d'un 3'OH et pas d'un 5' phosphate. On dit classiquement que la polymerase va "remplir" le site pour obtenir des extrémités franches.
A toi de voir si les sites que j'ai dessinés plus au sont compatibles avec une telle réaction.

3. La réponse est OUI pour les deux cas. A toi d'expliquer pourquoi.
4. Ecrit ce que deviens le site BamHI apres remplissage par la T4 pour voir si cela recrée un nouveau site apres ligation. Pour Pst1, c'est beaucoup plu simple si tu as répondu correctement a la question 2.

Bon courage
Yoyo

[brunop]

Salut,

Pour la question I :
BamHI le site de coupure deviens apres action de l'enzyme:
5'-------G3' 5'GATCC-------3'
3'-------CCTAG5' 3'G-------5'

Pour PstI:
5'-------CTGCA3' 5'G-------3'
3'-------G5' 3'ACGTC-------5'

On dit que BamHI crée des extrémités 5' sortantes, alors que PstI crée des extrémités 5' rentrantes.

Je te laisse conclure pour savoir si ta réponse 1 etait exacte ou non.

Question 2:
Ta réponse n'est pas bonne. L'amorce est le 3'OH crée par la coupure, l'ADN pol va pouvoir recopier les quelques nucléotides qui "sortent". MAIS l'ADN pol n'est capable de synthétiser l'ADN QUE de 3'->5'. Autrement dit elle ne peut amorcer la réaction qu'a partir d'un 3'OH et pas d'un 5' phosphate. On dit classiquement que la polymerase va "remplir" le site pour obtenir des extrémités franches.
A toi de voir si les sites que j'ai dessinés plus au sont compatibles avec une telle réaction.

3. La réponse est OUI pour les deux cas. A toi d'expliquer pourquoi.
4. Ecrit ce que deviens le site BamHI apres remplissage par la T4 pour voir si cela recrée un nouveau site apres ligation. Pour Pst1, c'est beaucoup plu simple si tu as répondu correctement a la question 2.

Bon courage
Yoyo

Mes nouvelles réponses :
Pour 2 :
On obtiendrait les polymérisation suivantes :
Pour Bam HI:
5'-------G3'
3'-------C5'
Pour PstI:
3'ACGTC-------5'
5'TGCAG-------3'

Donc si j'ai bien compris, on ne peut traduire :
Pour Bam HI :
5'-------CTGCA3'
Pour PstI :
5'G-------3'


Pour 3 :
Je pense que la réponse est oui car la ligase peut joindre aussi bien des extrémités franches que des extrémités cohésives. En revanche je ne connais pas la différence entre extrémités franches et cohésives.

Pour 4 :
Je pense que c'est oui dans les 2 cas car l'on a un palindrome.

Merci,

[Yoyo]

Bonsoir,

Tu as oublié l'autre partie du site de restriction! De plus, La polymérase va remplir le site pas dégrader les nucleotides "simple brin"...

Pour le reste il faut savoir que la ligase ne peut joindre que deux extremités de meme nature. cohesives avec cohesives; franches avec franches.
une extrémité cohésive (collantes) est:
5'--G
3'--CCTAG
(je ne représente que la moitié du site).

Une extrémité franche:
5'---GGG3'
3'---CCC5'
(il n'y a pas d'ADN simple brin).

il faut que tu revois ta réponse à la question 4 (dessine bien ce qui ce passe).

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[brunop]

Je commence à m'y perdre. Donc en reprenant le raisonnement :
" MAIS l'ADN pol n'est capable de synthétiser l'ADN QUE de 3'->5'. Autrement dit elle ne peut amorcer la réaction qu'a partir d'un 3'OH et pas d'un 5' phosphate."
Concernant Bam HI :
Je vais chercher un site de coupure 3'OH. Je trouve comme amorce pour Bam HI qu'un seul nucléotide G.Sachant qu'au départ on me donne 5'G-GATCC3', on peut écrire : 5'G-------3' 5'GATCC----3'
La seule lecture possible est 3'G-------5' car j'ai bien un 3'OH lié à la coupure. La séquence 5'GATCC----3' ne peut être lue car le site de coupure correspond à un 5' phosphate.
Concernant Pst I :
Pour les mêmes raison que précédemment la seule lecture possible sera 3'ACGTC----5'
Où se trouve mon erreur de raisonnement ?
Encore merci.

[Yoyo]

Ton erreur de raisonement viens du fait que la polymerase commence la synthese A PARTIR du 3'OH en recopiant le brin complémentaire.

donc pour BamHI cela te donne (il ne faut pas oublier que la synthese se fait sur les deux brins indifféremment):
............------->
5'-------GGATC3' 5'GATCC-------3'
3'-------CCTAG5' 3'CTAGG-------5'
.........................<-------

les fleches indiquent le sens de polymérisation de la polymerase. Et j'ai mis en rouge les nucléotides ajoutés par la polymérase
Bon je pense que la je t'ai fait 95% du travail le reste ne devrait plus poser de probleme.

Yoyo

[brunop]

Merci bien c'est trés clair.