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Détergent pour cellule humaine

  1. aeris010499

    Date d'inscription
    janvier 2009
    Âge
    31
    Messages
    7

    Détergent pour cellule humaine

    Bonjour,
    je suis confrontée à un problème : je travaille sur l'expression d'une proteine virale dans des cellules humaines que je ne parviens pas à solubiliser après extraction des protéines cellulaires. Un protocole est déjà au point pour l'expression chez la bactérie et la levure et cette étape de solubilisation permettant d'extraire la protéine des membranes fonctionne et pour cela nous utilisons du Chaps.
    Je souhaiterai donc utiliser un autre type de détergent qui serait plus efficace pour les cellules humaines. Cependant je ne trouve aucunes données précises sur le net ou ncbi, quelqu'un en connaitrait-il un? merci d'avance!

    -----

     


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  2. aeris010499

    Date d'inscription
    janvier 2009
    Âge
    31
    Messages
    7

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Personne pour m'aider?!
     

  3. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
    Localisation
    AP-HP
    Messages
    3 099

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Bonjour!
    Que voulez-vous faire avec cette protéine ensuite?

    V.
    Primum non nocere.
     

  4. aeris010499

    Date d'inscription
    janvier 2009
    Âge
    31
    Messages
    7

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Bonjour, merci de m'avoir répondu!
    Le but est d'obtenir suffisamment de protéine pour la voir en gel de coomassie et faire une étude de spectrométrie de masse par la suite. Je n'en ai donc pas besoin de beaucoup!
     

  5. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
    Localisation
    AP-HP
    Messages
    3 099

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Citation Envoyé par aeris010499 Voir le message
    Bonjour, merci de m'avoir répondu!
    Le but est d'obtenir suffisamment de protéine pour la voir en gel de coomassie et faire une étude de spectrométrie de masse par la suite. Je n'en ai donc pas besoin de beaucoup!
    Heu... si quand même...
    Si vous voulez passer en spectro de masse et voir votre protéine en coomassie il va falloir charger le gel un minimum.
    Je pense que vous pouvez travailler en Laemmli mais je ne fais pas de mass spec donc peut-être n'est ce pas compatible avec ce que vous souhaitez faire par la suite.
    Sinon on peut utiliser un très large panel de buffers dénaturants à base de Guanidium, Urée, Triton etc...

    V.
    Primum non nocere.
     


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  6. dirtncross

    Date d'inscription
    février 2005
    Messages
    127

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Bonjour,
    Quel type de cellules?
    Adhérentes ?
    Nico
     

  7. aeris010499

    Date d'inscription
    janvier 2009
    Âge
    31
    Messages
    7

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Bonjour, et merci pour vos réponse!
    ce sont des cellules HeLa qui sont adhérentes, pour répondre à vinc j'ai déjà essayé le laemli qui est compatible avec la spectro mais la solubilisation est mauvaise! Je me demande plutot s'il y a des détergents vraiment spécifiques des cellules humaines?
     

  8. piwi

    Date d'inscription
    janvier 2005
    Localisation
    Strasbourg
    Âge
    40
    Messages
    7 852

    Re : Détergent pour cellule humaine

    J'ai un peu du mal à cerner exactement le sens de votre question. Ce qui fait d'une cellule un cellule "humaine" c'est le matériel génétique qu'elle porte. En dehors de cela sa structure et son organisation ne diffère en rien d'une autre cellule animale.

    Peut être qu'en augmentant le SDS dans le leamelli à 0.2 ou 0.3% (au lieu des 0.1% habituels) et en faisant bouillir plus longtemps, vous parviendriez à extraire vos protéines des membranes.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
     

  9. dirtncross

    Date d'inscription
    février 2005
    Messages
    127

    Re : Détergent pour cellule humaine

    peut etre moyen de substituer le beta-mercaptoethanol par dithiotreitol (DTT) env. 10 mM final dans le Laemmli......
     

  10. aeris010499

    Date d'inscription
    janvier 2009
    Âge
    31
    Messages
    7

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Il y a déjà du DTT dans mon tampon de laemmli mais je vais essayer d'augmenter le pourcentage de SDS et voir si ça fonctionne
     

  11. Vinc

    Date d'inscription
    février 2004
    Localisation
    AP-HP
    Messages
    3 099

    Re : Détergent pour cellule humaine

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    J'ai un peu du mal à cerner exactement le sens de votre question. Ce qui fait d'une cellule un cellule "humaine" c'est le matériel génétique qu'elle porte. En dehors de cela sa structure et son organisation ne diffère en rien d'une autre cellule animale.
    Je pense que la question était surtout : est ce qu'un protocole pour levure ou bactérie fonctionne en cellule mammifère? non?


    Citation Envoyé par dirtncross
    peut etre moyen de substituer le beta-mercaptoethanol par dithiotreitol (DTT) env. 10 mM final dans le Laemmli
    Plutôt 100mM final... Et le beta mercapto a exactement le même mode d'action que le DTT.

    V.
    Primum non nocere.
     


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