Extraction d'ADN génomique

[ozeir]

Bonjour,

Est-ce que quelqu'un peut me donner un protocole d'extraction de l'ADN génomique de levure et qui marche bien avec lui?

moi j'utilise le"quick yeast DNA PREP" et j'ai toujours des problèmes soit contamination par l'ARN soit j'arrive pas à digérer l'ADN...

quelqu'un peut m'aider

Merci d'avance

[Yoyo]

Salut

j'ai un protocole super simple et tres rapide, mais ca ne différencie pas l'ADN de l'ARN. Si tu es géné par une contamination ARN pourquoi ne pas mettre de la RNAse dans ton tube?
YOyo

[ozeir]

Bonjour,

je traite toujours l'extrait à la RNase et meme après traitement il en reste toujours de l'ARN...

C'est pas l'ARN le problème c'est plutot la mal digestion de l'ADN...
Et mon grand problème est que j'arrive pas à digérer une grande quantité d'ADN(200 Ml dans un volume de 500 Ml)mais dans un petit volume(10Ml dans 15Ml)j'arrive à digérer mon ADN...(concentration d'ADN est 400 ng/Ml)
j'utilise le SAU3A pour la digestion.
Et moi je veux faire une banque pour idenifier une mutation donc ca marche pas avec moi la petite digestion...

Est-ce que vous avez rencontrez un problème pareil??

Et vous pouvez"YOYO" m'envoyez votre protocole SVP pour l'essayer.

Merci d'avance

Très cordialement

[piwi]

Rassurez moi! Ml c'est pour µl? Parce qu'une digestion dans 500 ml finaux ça me semble absolument suréaliste.

C'est quoi votre protocole? Si vous ne donnez pas plus de détails on ne voit pas bien où cela pourrait clocher.

Cordialement,
piwi

[flow83]

peut-être que je dit une bêtise mais pourquoi ne pas essayer avec d'autres enzyme de restriction? ou alors, regarde si tu peut utiliser encore le même enzyme mais avec un Buffer différent.
Après, je sais qu'il existe certains sites pour faire tes prédictions de digestion mais je connais que pour les bacteries.

[ozeir]

Bonjour,

désolé Piwi peut-etre j'étais pas précis.Oui Ml=micro litre et ng=nano gramme.

Pour le protocole"quick yeast DNA prep":
après recupération des cellules par centrifugation,
j'ajoute du lysis buffer, des billes de verres, du phénol/chloroforme,
vortex,
petite centrifugation,
ajout e TE(tampon)
centrifugation 10 min,
ethanol,centrifugation,
TE et RNase,
PEG, centifugation,
puis ajout du TE.

en suivant ce protocole, j'arrive à avoir une concentration d'ADN de 400 ng/Ml mais toujurs j'arrive pas à le digérer(dans un grand volume)

Voila, j'espère que vous pouvez m'aider maintenant..

Et pour l'utilisation du SAU3A, c'est parceque je veux faire une digestion partielle pour faire une banque et parcequ'elle est compatible avec BamH1. Et pur le tampon c'est le tampon B2 qui est normalement spécifique du SAU3A.

Merci pour vos réponse.

Cordialement

[Yoyo]

Salut

Donne moi ton mail par MP, je t'enverrai mon protocole.
SAu3A n'est pas sensible a la méthylation par hasard?

YOyo

[piwi]

Sensible à la méthylation des CpG. Donc ça ne vient pas de là son problème. Et de toute manière le souci c'est que ça fonctionne dans un petit volume et cela ne fonctionne plus dans un plus gros volume.
C'est assez étrange. J'aurais plutôt tendance à penser à un mauvais ratio ADN/buffer/enzyme/volume final. Il ne change pas entre les petits volumes et les grands.
Vous dites mettre 10µl dans 15 µl final. Jimagine que vous devez avoir quelque chose du genre
ADN--- 10µl
Buffer---1.5µl
Enzyme_1.5µl
H₂O QSP 15µl

Donc en passant à 500µl finaux vous devriez avoir:
ADN--- 333µl
Buffer---50µl
Enzyme_50µl
H₂O QSP 500µl

C'est bien ce que vous faites?

Cordialement,
piwi

[ozeir]

Bonjour,

pour la digestion:

ADN--- 10µl
Buffer---1.5µl
Enzyme_0.5µl
H2O QSP 3µl
volume total:15µl
Avec 1µl d'enzyme, dans 10min tout est digéré.

Pour le 'grand volume':

ADN--- 300µl
Buffer---50µl
Enzyme_10 et 15µl
H2O QSP 240µl
volume total:500µl

Je peux vous joindre si vous voulez le resultat d'électrophorèse...
Moi et mon encadrant, on n'arrive pas à comprendre pourquoi et comment ca se passe...

Merci

[piwi]

Avec 1µl d'enzyme, dans 10min tout est digéré.

J'ai du mal à croire que vous puissiez digérer tous les sites Sau3A de 4µg d'ADN génomique en 10 minutes.

NEB indique qu'il faut 1 unité pour digérer 1µg d'ADN lambda en 1h. La taille du bidule est de 50 000. PM nucléotide = 330 ==> MM = 33.10⁶g/mol. Du coup dans 1µg vous avez 3.10^-8 moles d'ADN lambda. Ceci représente 18.10⁹ phages. Comme il y a environs 200 sites de coupures Sau3A par phage vous pouvez donc dire à la louche qu'une unité d'enzyme coupe environs 3,6.10¹² sites en 1 heure.

Un génome humain fait 3.10⁹pb ce qui représente 12.10⁶ sites de coupures pour l'enzyme. un génome fait 2.10¹² g/mol Ce qui fait que dans 1µg on trouve
5.10^-19 moles de génome soit en gros 300 000 génomes. C'est à dire là encore 3,6.10¹² sites
Il faudrait donc au minimum 1h à 1U de votre enzyme pour tout digérer. Or vous ne mettez que 2U (4U/µl chez NEB) dans votre petit mix avec 4µg d'ADN. Donc il faudrait 2h. On est loin des 10 minutes.

Or dans votre grand mix vous diminuez encore votre ratio d'enzyme. Du coup il faut soit digérer beaucoup plus longtemps soit augmenter la durée de digestion. Je vous conseille de jouer sur les deux paramètres.

Cordialement,
piwi

[piwi]

Pris dans mon petit calcul je sentais bien sans la toucher qu'il y avait une manière plus simple d'arriver à la solution. Je viens de la voir, c'est parfaitement stupide. 1µg d'ADN lambda = 1µg d'ADN génomique (si on considère les bases réparties de manière aléatoires et homogènes. Ce qui est faux mais que l'on fait toujours).
Du coup on arrive immédiatement au fait qu'il faille bien 1h à 1U de Sau3A pour couper 1µd d'ADN génomique donc 2h à 2U pour couper 4µg.
Evidemment ma conclusion ne change pas. C'est juste pour la beauté de la science

[Yoyo]

C'est juste pour la beauté de la science

c'est beau la science expliquée par Piwi
belle démonstration d'un calcul que je me donne jamais la peine de faire!

Va peut etre falloir que je revois la facon d'encadrer mes etudiants

YOyo

[piwi]

Du coup il faut soit digérer beaucoup plus longtemps soit augmenter la durée de digestion. Je vous conseille de jouer sur les deux paramètres.

Je dois être bien fatigué moi. C'est durée de digestion et quantité d'enzyme. Augmentez les deux.

[Biob]

Petite remarque mais j'ai envie de la faire quand même !
Est-ce que le tampon TE (avec son EDTA) ne générait pas la digestion?
Autrement dit, pourquoi ne pas dissoudre son ADN dans de l'eau, histoire d'éviter les problèmes lié au tampon (vieillissement, oxydation, dégradation, "pH modifié"....etc.) ?!

[piwi]

Je me suis posé la même question en première lecture mais après coup je me suis dis que ce n'était pas du TE "textbook" dont il était question mais la solution TE du kit. En général les kit ont un tampon d'elution spécial pour leur résine et qui est optimisé pour pouvoir faire ses prep derrière. A mon avis il n'y a pas grand chose à chercher de ce coté là.

Cordialement,
piwi