apoptose cytométrie

[inviteec077029]

Bonjour,
je vais bientôt faire de la cytométrie pour la première fois pour détecter de l'apoptose dans des culture primaires de fibroblastes humains.
Je vais regarder l'apoptose à l'état basal et à des états induit avec la staurosporine et l'A23187.
Je vais utiliser la technique annexine 5/ PI pour pourvoir faire la différence entre les cellules nécrotique et apoptotique.
Quelqu'un aurait déjà utilisé cette technique sur des fibro humain? et si oui à quelle concentrations et le temps nécessaire pour la staurosporine puisse induire de l'apoptose ?
Quelqu'un à déjà utilisé le logiciel DIVA pour l'analyse des résultats en cytométrie savez-vous si il est gratuit?

Aussi si vous avez des conseils pour la manips je suis preneur

Merci pour vos éventuels réponses
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[sansplomb]

Bonjour,

pour les cellules adhérentes on préfère utiliser le DiOC6 couplé avec de l`IP. Il y a souvent du bruit de fond avec l`annexine après le traitement pour récupérer les cellules adhérentes.
Il faut pas oublier de récupérer le surnageant de culture qui contient les cellules apoptotiques.
DIVA est pas gratuit par contre vous pouvez télécharger WinMDI.


cordialement

[inviteec077029]

Si j'ai bien compris vous avez déjà fait un marquage annexin/Pi est donc il y a souvent du bruit de fond et par conséquent vous préfériez faire un marquae DiOC6/Pi c'est bien cela?
J’ai quelques petites questions :
Vous avez utilisé quel type de traitement ? Vous avez obtenus quel genre de bruit de fond, Inexploitable ? Comment vous récupérer les cellules ?trypsine?

Merci pour votre réponses

[inviteec077029]

aussi autre question vous fixer vos cellules au préalable?

[A voir en vidéo sur Futura]

[sansplomb]

Bonjour,

on a travaillé sur des lignées adhérentes traitées avec des cocktails de chimiothérapies.
Après plusieurs essais en annexine on a préféré prendre le DiOc6. En annexine on avait une augmentation du marquage sur les cellules non traitées.
Les cellules étaient trypsinisées, non fixées (la fixation perméabilise les cellules).
En plus le DiOc est nettement moins onéreux que l`annexine.
Dans tous les cas un technique d`apoptose doit souvent être confirmée par une autre technique (parfois un simple trypan).


cordialement

[inviteec077029]

Merci pour votre réponse.
Aussi une dernière question concernant le surnageant de culture qui contient les cellules apoptotiques.
Je n’avais pas eu l’idée de récupérer le surnageant en effet les cellules apoptotiques perdent de l’adhérence par conséquent il est important de le faire
Je cultive dans des boites 100mm je récupère les 10 ml ensuite j'en fais quoi je concentre? Pouvez-vous me décrire votre protocole ? Le résultat est significatif en cytométrie ?