Southern blot !!!

[cysto]

Bonjour tout le monde... A quoi sert svp l'adn du sperme du saumon dans la technique du southern blot ?? et aussi par conséquent, à quoi sert la préhybridartion !!! merci de me répondre !
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[Flyingbike]

L'ADN de sperme de saumon permet, pendant le southern blot (et d'autres techniques comme le gel shift (EMSA)), d'empêcher les interactions non spécifiques avec la sonde (un peu comme la BSA ou le lait dans les western blot ou en immunohistochimie)

[Guillaume69]

Bonsoir,

La question tombe bien, car je n'ai pas tout compris sur cette étape du protocole.

Plus précisément, si on ne l'utilise pas, on a des intéractions nitrocellulose-sonde parce que la membrane est chargée positivement (liaisons hydrogènes ou électrostatiques ?) et que la sonde est ainsi "bloquée".
C'est bien ça ?

On veut donc que ce soit l'ADN de sperme de saumon, et non notre sonde, qui se fixe non spécifiquement à notre membrane, d'où cet ajout en quantité saturante.
J'ai juste ?

Ne peut-on pas craindre que notre sonde ne se fixe sur l'ADN de sperme de saumon et non sur nos fragments d'ADN d'intérêt ?

Dernière question : pourquoi du sperme de saumon ? Ca se trouve facilement et ce n'est pas cher ?

[Flyingbike]

La question tombe bien, car je n'ai pas tout compris sur cette étape du protocole.

Plus précisément, si on ne l'utilise pas, on a des intéractions nitrocellulose-sonde parce que la membrane est chargée positivement (liaisons hydrogènes ou électrostatiques ?) et que la sonde est ainsi "bloquée".
C'est bien ça ?

On veut donc que ce soit l'ADN de sperme de saumon, et non notre sonde, qui se fixe non spécifiquement à notre membrane, d'où cet ajout en quantité saturante.
J'ai juste ?

voila

Ne peut-on pas craindre que notre sonde ne se fixe sur l'ADN de sperme de saumon et non sur nos fragments d'ADN d'intérêt ?

non, ta sonde aura toujours plus d'affinité pour son complémentaire (ta cible) que sur des séquences lambda

Dernière question : pourquoi du sperme de saumon ? Ca se trouve facilement et ce n'est pas cher ?

oui, ca se vend par plusieurs grammes sous forme solide, ca ressemble un peu a du coton. Il y a d'autres alternatives, par exemple le dIdC.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Guillaume69]

Mais si la sonde, qui est en quantité saturante je crois, rencontre un ADN de saumon à peu près complémentaire, pourquoi irait-elle voir ailleurs s'il n'y a pas un ADN qui lui correspond mieux ?

Par ailleurs, ne peut-on pas imaginer que lorsque l'on utilise des sondes courtes, on puisse trouver aussi des séquences exactement complémentaire de la sonde avec une probabilité élevée ?

[Flyingbike]

je ne crois pas que l'adn de saumon soit en quantité saturante. Il ne faut pas oublier que ton fragment d'intérêt a migré sur un gel, et est donc concentré sur une petite surface, ce qui n'est pas le cas de l'adn de sperme. Je seche un peu quand même parce que c'est plus vraiment une technique d'actualité

[cysto]

oulala, je suis d'autant plus embrouillée avec toutes ces questions Guillaume69, déjà que je me trouvée à la marge de toute cette histoire ...voilà que je me retrouve éjéctée ...loool.
Merci pour tes précisions Flyingbike, mais j'ai mal saisi un truc: qu'est ce que tu appelles interactions non spécifiques avec la sonde !!!
le but de la sonde est de detecter l'adn d'interet , alors pourquoi la préhybridation vu qu'elle va s'hybrider avec notre adn recherché ?!...
Et sinon, concernant l'adn du sperme du saumon, j'ai lu sur un bouquin qu'il est sans lien avec les molécules séparées ...qu'est ce qu'ils sous-entendent par "molécules séparées" serait ce les mono brins par hasard ?!
Merci les jeunes !

[Guillaume69]

Désolé...

Ta membrane de nitrocellulose possède les fragments d'ADN qui ont migré.
Tu veux, grâce à ta sonde radioactive, révéler spécifiquement certaines séquences.

Or ta sonde, comme tous les ADN, est chargée négativement.
Donc quand tu la place met en contact avec ta membrane, elle se fixe n'importe où (où elle trouve des charges +).
Comme la sonde est utilisé de manière saturante (on met une grande quantité de sonde), la seule chose que tu risque de voir en procédant ainsi c'est... un marquage uniforme, du noir partout !

C'est pour cela qu'avant de mettre les sondes en contact avec la membrane, on met la membrane en contact avec de l'ADN de saumon qui la recouvre entièrement.
La sonde n'a donc "plus accès" aux charges positives, et ne peut plus se fixer sur la membrane, de manière non spécifique.

La seule façon qu'elle a de se fixer c'est de reconnaitre un ADN complémentaire.
Ce faisant, tes sondes remplissent bien leur rôle : mettre en évidence après autoradiographie des séquences spécifiques

[cysto]

OOk d'accord, voilà qui est mieux merci GUILLAUME, c'est on ne peut plus clair ...

[invite57fcd3de]

Quelqu'un pourrait-il nous expliquer ce qu'est le southern blot de manière claire et précise...et simple bien entendu parce qu'il nous est difficile de comprendre! C'est très urgent! Merci d'avance!