Sequençage de l'ADN

[seminole]

Salut tout le monde

Voilà une video des nouvelles méthodes de séquençage de l'ADN, est-ce que quelqu'un se sent capable de me la détailler.

http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc

Merci
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[invite44c2d7cd]

Belle video en tout cas ^^ .

[invitef08e6467]

Yeah le 454!!!

Brièvement le pyroséquençage 454 consiste à séquencer des fragments de qqs 100aine de paire de bases... tu branches des adaptateurs et lies un unique fragment sur une micro bille. Tu amplifies le fragment et tu te retrouves avec une bille qui contient plusieurs millions de clones de ton fragment. Tu vas ensuite séquencer en introduisant par complémentarité tes nucléotides et à chaque cycle tu mesures l'intensité de fluorescence... rien = pas le bon nucléotide, la fluorescence est fonction de nombre de nucléotides identiques qui se suivent sur ta séquence (c'est d'ailleurs le problème de cette méthode, tu perds la précision passé trois nucléotides identiques dessuite.).
Après cela il faut passer au "contiguage" des millions de séquences que tu as généré, et là ça se gâte...

Pour en savoir plus cherche "séquençage roche 454"... Sinon il existe d'autres méthodes (Solid et Solexa notament) si tu es intéressé(e).

[seminole]

Merci Julilou, je vais voir ce que je trouve

[A voir en vidéo sur Futura]

[seminole]

Salut Julilou, j'en reviens à toi car tu as l'air de t'y connaitre.

Premièrement: comment fais tu pour casser l'ADN en plusieurs morceaux de petites tailles et surtout de même taille, approximativement 100 B ?
Deuxièmement: Ensuite comment fais tu pour coller un adaptateur à chaque morceaux d'ADN, ils sont tous codés différemment ? C'est de la biotin sur de la streptavidin.

???
Merci

[invite899b80e1]

Salut on a déjà utilise pyroséquencage au labo et devrais en refaire d'ici peu. Je vais essayer de répondre:

Brièvement le pyroséquençage 454 consiste à séquencer des fragments de qqs 100aine de paire de bases...

On en est à 400pb maintenant

Ensuite comment fais tu pour coller un adaptateur à chaque morceaux d'ADN, ils sont tous codés différemment

Par simple PCR avec des amorces pouvant s'hybrider sur les billes

[invitef479c613]

salut
ce vidéo me plait bcpbcp j'aimerai bien etudier les choses au niveau moléculaire ...ça me fait plaisir
...merci bcp

[invitef08e6467]

Seminole tu me surestime beaucoup... j'en connais pas tellement...

Pour les fragments de 100 bp je sais pas exactement mais il me semble que c'est mécanique... j'imagine mal qu'il existe une enzyme super bien élevée qui coupe tout les 100 paires de bases (quoi que)...

[LXR]

Ca dépend, les enzymes de restriction reconnaissant des sites de restrition courts, 3 bases par exemple, clivent selon un calcul probabiliste toutes les 64 paires de bases. Pour les sites de restriction de 4 bases, leur fréquence est en moyenne toutes les 256 bases.

Greg

[invitef08e6467]

En effet je suis d'accord avec toi mais les calculs probabilistes ça marche si la répartition des nucléotides est aléatoire et régulière, or on sait que certaines zones sont plus riches en G-C et d'autres en A-T...

En l'occurrence, les fragments sont je pense précisément de la taille voulue (36bp bientôt 100bp pour du Illumina Solexa, et je crois 500bp pour du Roche 454)

[amaranth]

salut
euh , qui peut m'expliquer les étapes d'Illumina
merci =)

[Edelweiss68]

salut
euh , qui peut m'expliquer les étapes d'Illumina
merci =)

Vous avez du regarder trop rapidement ce document : http://www.technolabo.ma/TL5-1.pdf

Car les différentes étapes sont illustrées sur la figure 7.

[amaranth]

salut Edelweiss68 =)
oui je l'ai vu, et même cette védéo
http://www.youtube.com/watch?v=77r5p...eature=related
bon à part la fragmentation de l'ADN par nébulisation (vapeur ou liquide) suivie de la fixation des adaptateurs, et la migration des segment sur le gel, les autres étape, je t'assure que j'ai rien compris et déjà c'est quoi P5 et P7 c'est quoi leur rôle exactement? et quels sont les critairs des adaptateurs???
merci

[piwi]

J'imagine que vous avez compris les étapes d'amplification et de dénaturation.
Ce qu'il faut comprendre c'est que le séquencage commence réellement avec l'hybridation d'un primer spécifique de l'adaptateur sur l'ADN simple brin. La suite ressemble un peu au séquencage classique avec une ruse un peu sioux.
L'idée est toujours d'amplifier l'ADN. On utilise donc une polymérase avec 4 oligonucléotides. Contrairement à la technique de Sanger, les nucléotides sont tous marqués par un fluorochrome (un différent pour chacun des 4 nucléotides) qui bloque la progression de la polymérase.
La polymérase intègre le premier nucléotide puis s'arrête. L'illumination va permettre de révéler puis cliver le groupement bloquant. Et la synthèse se poursuit avec le second nucléotide... Etc

Une autre astuce de la technique est que l'ADN à séquencé est clivé en petits fragments (une vingtaine de pb) qui vont être chacun fixés sur une plaque couverte de séquences fixant les séquences adaptatrices. Arpès amplification on a donc des spots sur la plaque formés par les amplicons issu d'un brin initial. Ce sont ces clones (si l'on peut dire) qui permettent de générer un spot de fluorescence qui sera détecté à chaque étape de polymération. Cette stratégie permet de séquencer en parallèle plusieurs régions de l'ADN. Ensuite, une fois tous les fragments séquencés, on reconstitue le brin d'ADN initial par informatique.

Cordialement,
piwi

[amaranth]

salut
merci piwi là j'ai bien compris, mais concernant l'étape de P5 et P7 de la védéo, non????
merci encore