bonjour,
j'ai fait un TP ou on a purifié un domaine de liaison a l'ADN et je suis sur que pour l'examen qu'en passe dans 2 joursils vont nous demandé les techniques permettant d'étudier cette liaison!!!
alors svpest ce que quelqu'un peut me donner une ou deux technique avec le principe si c'est possible
A priori je dirai immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), dont le principe consisite à fixer la séquence d'ADN à laquelle tu t'intéresse sur des billes d'une colonne de chromato, puis à faire passer dans cette colonne les protéines dont tu suspectes la liaison à la séquence considérée. Après élution, tu récupères la protéines liée.
Ceci est le principe très global, je ne rentre pas dans les détails.
Il y a aussi une technique tres puissante et relativement "simple" qu'on appelle le "gel shift" ou EMSA (electromobility shift assay)
Ca consiste à
-préparer une petite séquence d'ADN susceptible de lier des protéines
-incorporer dans cette sequence des nucléotides radioactifs (P32 CTP par exemple)
-déposer sur gel d'acrylamide non dénaturant cette "sonde" en excès dans les puits
-déposer des extraits de protéine totales ou une protéine purifiée
-faire migrer la sonde et les protéines dans le gel
-réveler sur un film photographique
En gros, ta sonde libre va migrer en bas du gel, et en présence d'une interaction avec une protéine, le complexe ADN-protéine sera ralenti dans le gel puisque plus gros : il apparaitra une bande radioactive dite "retardée"
Selon les cas, tu peux vérifier quelle protéine interagit avec ton ADN en ajoutant a ton mix ADN+ protéines un anticorps dirigé contre ta protéine d'intéret. Dans ce cas deux solutions :
-l'interaction se fait avec une autre protéine : pas de différence avec ADN+prot seuls
-l'interaction fait intervenir la protéine que reconnait l'anticorps
@@et la liaison de l'anticorps produit une bande encore plus retardée (ADN+prot+anticorps), le "supershift"
@@ou la liaison de l'anticorps empêche la protéine de se fixer a la sonde : disparition du shift
Il y a une autre technique d'immunoprécipitation de chromatine :
pour déterminer quelles sont les séquences d'ADN reconnues par une protéine X
-tu incubes des fragments d'ADN génomique avec une protéine X
-tu ajoutes aun anticorps anti-X pour agglomérer la protéine X liée a des séquences
-tu centrifuges pour précipiter ces complexes
-tu récuperes les séquences précipitées que tu peux ensuite séquencer.
