Du DTT dans mon buffer de RT-PCR

[invitef08a311f]

Salut à vous,

Simple et élémentaire. Y'a du DTT dans mon buffer de RT-PCR et connaissant ses fonctions biochimiques très réductrices je me demandais ce qu'il faisait là?

Merci d'avance

BB
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[piwi]

J'en ai dans mon buffer de transcription en plus de la RNasine (inhibiteur des RNases). J'imagine qu'il est là pour bloquer une éventuelle RNase.

Cordialement,
piwi

[invitef08a311f]

En fait je me demandais ce qu'il faisait en détail (au niveau biochimique). Je suis un peu curieux et friand de détails moléculaires.
J'ai aussi une RNAsine dans mon buffer. Le DTT, en général, détruit les ponts disulfures, mais alors comment expliquer qu'il ne le fasse pas avec la RT, qui, je pense, doit aussi en avoir (ou peut-être pas).

Merci d'avance,

BB

[Flyingbike]

le DTT apparemment améliore l'activité polymérase (je sais pas comment), mais il permet aussi d'éviter les structures secondaires dans l'ARN (je ne sais pas comment non plus...)

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

En protéomique on s'en sert éventuellement en remplacement du b-mercapto. Du coup j'ai du mal à comprendre comment un truc pareil peut activer une polymérase.

[kamor]

Le DTT détruit les ponts disulfures comme le b-mercapto.
Je le verrai donc plutôt comme un inhibiteur de RNases

[LXR]

Le DTT détruit les ponts disulfures comme le b-mercapto.
Je le verrai donc plutôt comme un inhibiteur de RNases

La question était plutôt de savoir, me semble-t-il, en quoi le DTT serait suffisamment spécifique des RNases pour ne pas présenter un inconvénient pour les autres protéines du mix.

Dans la cellule eucaryote, l'environnement est plutôt réducteur à cause du glutathion. Pour la formation de ponts disulfures spontanés, il faut être dans des conditions oxydantes. Donc les protéines nécessitant des ponts disulfures pour leur structuration passent par la voie sécrétoire où elles rencontrent dans le RE une enzyme catalysant la formation de ces ponts (je ne me rappelle plus son nom mais c'est assez facile à trouver ). Donc les protéines membranaires et sécrétées présentent souvent des ponts disulfures alors que peu de protéines nucléaires ou cytosoliques en ont.

Faites un tour sur expasy et amusez vous à tester quelques protéines sécrétées ou cytosoliques que vous connaissez en regardant avec ProDom, Interproscan ou autre (encore une chose que j'ai oublié...) qui permet de visualiser les ponts disulfures d'une protéine. Presque à chaque coup, une protéine sécrété en contient au moins un, alors que je n'ai encore jamais vu de ponts SS dans une protéine nucléaire ou cytosolique.

Les protéases et RNases (pas sûr) sont sécrétées donc il y a de fortes chances qu'elles contiennent des ponts SS. La RT et les polymérases ne provenant pas de cellules eucaryotes, je ne saurais vous renseigner là-dessus...Mais probablement qu'elles n'en contiennent pas si nos réactions de BM marchent si bien avec DTT.

Greg

[invitef08a311f]

Wow. Effectivement, la RT qu'on utilise est tirée des retrovirus qui font pratiquement tout dans le milieu cytosolique réducteur de la cellule. Il semble normal que les protéines utilisées par le virus ne peuvent pas avoir de pont disulfure... et donc que le DTT ne l'affectera pas.
Maintenant que j'y pense... ch'uis con

Merci à tous! Et spécialement à LXR.

Passez une très bonne soirée.

BenCalif

[mantOs]

Wow. Effectivement, la RT qu'on utilise est tirée des retrovirus qui font pratiquement tout dans le milieu cytosolique réducteur de la cellule. Il semble normal que les protéines utilisées par le virus ne peuvent pas avoir de pont disulfure... et donc que le DTT ne l'affectera pas.
Maintenant que j'y pense... ch'uis con

Merci à tous! Et spécialement à LXR.

Passez une très bonne soirée.

BenCalif

Ca ne veut rien dire que les rétrovirus font pratiquement tout dans le cytosol.

[LXR]

Oui les rétrovirus n'ont pas de cytosol!

Les RT, polymérases & co utilisées en BM sont probablement produites par des systèmes d'expression qui possèdent leur propre lot de modifications post-traductionnelles. Donc il faut plutôt chercher à ce niveau...

Greg

[Flyingbike]

petit complément : le DTT n'est pas capable de réduire les ponts enfouis. Je suis presque sur que ce n'est pas une histoire de RNases.

[Flyingbike]

Après moultes recherches, le DTT est nécessaire a l'activité de la polymérase (site de NEB). Pour ça ils citent un papier de 1996 que je n'ai malheureusement pas pu trouver...

[piwi]

A en croire ce document: http://www.bio.net/bionet/mm/methods...er/078636.html , le rôle du DTT n'apparait pas très clair.
J'ai presque envie de dire "la légende" dit qu'il est nécessaire pour activer la RNasine.

On peut aussi regarder ça: http://www.ambion.com/techlib/tn/82/823.html

[JPL]

[HS]Les articles d'Hervé This sur la cuisine moléculaire donnent généralement des explications plus claires des pratiques traditionnelles des cuisiniers [/HS]

[LXR]

L'aspect "cuisine hasardeuse" est sans doute ce qui m'agace le plus dans la vie de laboratoire. Entre les explications divergentes selon le "vécu" de chacun, les informations de base sérieuses introuvables (à moins d'y passer une journée), le secret entretenu par les compagnies commerciales quant au fonctionnement exact de leurs produits ou kits et le manque de temps pour connaitre certains détails expérimentaux (plus par plaisir que par nécessité, quoique...), cela devient frustrant...

Je suis sûr qu'Hervé This s'en tire mieux que nous....mais lui n'a pas de biblio à faire à côté! [//HS]

Greg

[JPL]

J'ai souvenir d'un certain nombre de recettes de cuisine assez empiriques, voire irrationnelles, en histologie et en microscopie électronique qu'on appliquait par tradition et dont j'ai dû m'affranchir à plusieurs reprises pour obtenir de bons résultats. Du coup j'ai introduit les miennes mais au moins la plupart (euh, peut-être pas toutes) étaient-elles raisonnées.

[invitef08a311f]

Merci de ton aide Mantos. C'est ce genre de remarques que tout le monde devrait faire, c'est sûr que ça avancerai plus vite comme ça.

Bravo

Bencalif