Explications rapides sur la PCR

[invite23b5ba7c]

Bonjour, je viens d'avoir un cours sur la PCR, mais je n'ai pas compris grand chose. Je me suis vraiment accroché pendant 1h30, sur toute la partie au sujet des Southern blot, Northern blot, Western blot, mais au moment de passer au PCR, j'ai décroché une vingtaine de secondes et j'me suis retrouvé complètement paumé, à prendre des notes que je ne comprenais pas.

Je sais que c'est un moyen de multiplication ( amplification ) d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
Je sais que ça fonctionne par cycles, et que ces cycles sont conditionnés par des variations de température.

Mais après plus rien, et sur le net je ne trouve pas mon bonheur ...

On a parlé de :

Duplication de séquence encadrée par des couples d'amorces ...
Couples d'amorces ( amorce sens, amorce anti-sens, oligo-nucléotides ... )
Séquences oligoDT ( ? ) correspondant à de l'ADN synthétique simple brin ...
Séquence anti-sens ...
Thermocycleur ...
ARN polymérase thermostable chez archéobactérie ( apparemment c'est ça qui rend la PCR pratiquable, sans quoi il faudrait remplacer à chaque cycle l'ARN polymérase "usée" et dénaturée par la chaleur ) ...
Abaisser la température pour permettre une renaturation ...
ADN mise en excès favorisant une hybridation des amorces sur leu cible ...
Extension des amorces ...

Quelqu'un pourrait-il m'aider ? J'aurai surtout besoin des infos de base ( qu'est ce que ça permet d'amplifier, les différentes étapes, des petites explications des notions clés un peu plus haut ... ).

Un grand merci d'avance, ça me lèverait un gros poids
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[kamor]

Duplication de séquence encadrée par des couples d'amorces ...

C'est LA base de la PCR, l'ADN polymerase a besoin d'une amorce pour commencer la réplication de l'ADN. L'idée de génie est de créer cette amorce pour amplifier un morceau d'ADN souhaitée. Comme il y a deux brins sur une molécule d'ADN, il en faut deux.
Explication plus imagée ici

Couples d'amorces ( amorce sens, amorce anti-sens, oligo-nucléotides ... )

On fonctionne avec des nombres pairs d'amorces car il y a deux brins d'une part, ça permet donc de multiplier la vitesse de fabrication de ces amplicons et de plus ça réduit la taille des amplicons, car au fil des cycles de plus en plus d'amplicons seront de la taille déterminée par les amorces.

Séquence anti-sens ...

Les brins d'ADN ont un sens, il y en a un qui est 3'-> 5' et l'autre 5'->3'. Cela donne un sens à ces deux molécules.

Thermocycleur ...

La machine qui permet de passer très rapidement aux différentes températures correspondant aux différentes étapes de la PCR

ARN polymérase thermostable chez archéobactérie ( apparemment c'est ça qui rend la PCR pratiquable, sans quoi il faudrait remplacer à chaque cycle l'ARN polymérase "usée" et dénaturée par la chaleur ) ...

Classiquement, Thermus aquaticus, bactérie des grand fonds. les températures de la PCR sont comprises entre 50 et 95°C. Or à ces températures, les protéines sont souvent sans structures tertiaires donc sans activité. Comme cette bactérie vit près des sources chaudes, ces protéines résistent très bien à ces températures.

Abaisser la température pour permettre une renaturation ...

A haute température, dénaturation de l'ADN comme des protéines, il y a séparation des 2 brins. On descend la température, processus inverse.

ADN mise en excès favorisant une hybridation des amorces sur leu cible ...

Je dirais plutôt que les amorces en excès augmentent la probabilité que celles ci s'hybrident avec l'ADN simple brin, et évite ainsi la renaturation de l'ADN en double brin. On met pas l'ADN en excès.

Extension des amorces ...

Etape 3 de la PCR

[gorben]

Salut,
Petite precision pour completer Kamor :

Je sais que c'est un moyen de multiplication ( amplification ) d'une séquence d'ADN ou d'ARN.

De part son principe la PCR ne peut marcher que sur de l'ADN double brin (peut etre eventuellement sur le l'ARN double brin mais j'en ai jamais entendu parler).
A+

[Guillaume69]

Salut,
Petite precision pour completer Kamor :



De part son principe la PCR ne peut marcher que sur de l'ADN double brin (peut etre eventuellement sur le l'ARN double brin mais j'en ai jamais entendu parler).
A+

Pour compléter encore : c'est pour cela que lorsque l'on veut "amplifier un ARN", par exemple pour avoir une banque de transcrits, on passe d'abord par une étape de RT = Reverse Transcription (transcription inverse) à l'aide d'une réverse transcriptase (transcriptase inverse) qui permet un passage ARN => ADN.
L'ADN ainsi obtenu n'est pas de l'ADN génomique mais de l'ADN complémentaire d'un ARN (pas d'intron, une queue polyA éventuellement, ...) : il est appelé ADNc.
C'est ensuite cet ADNc que l'on amplifie et que l'on conserve ; l'ARN n'est jamais conservé.

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

Merci gorben et guillaume, j'étais passé à côté de ce peti mot
Juste pour compléter, la reverse transcriptase quand à elle nous a été offerte par les virus à ARN

[invite23b5ba7c]

Ok, un gros merci à vous tous, je pense que j'ai compris l'essentiel.

Un denier petit truc ( j'ai un trou de mémoire ) :

L'amplification par des plasmides, ça permet de multiplier une séquence d'ADN simple ou doube brin ?

Enfin, quelqu'un peut-il me faire un petit résumé rapide des avantages / inconvénients / spécificité de ces deux méthodes ( amplification par plasmide, et amplification par PCR ) ?

Merci d'avance, sincéremment ^^.

[Guillaume69]

Un plasmide est un ADN db. L'amplification se fait donc sous forme double brin.

[invite23b5ba7c]

En gros la PCR c'est proche d'une réplication artificielle et imposée de l'ADN ?

Comment la synthèse des nouveaux brins parvient à trouver assez de nucléotides pour se faire ? On ajoute régulièrement des nucléotides pour alimenter la réaction ?

[Flyingbike]

en général on s'arrange pour en avoir assez dès le début. Ca suffit pour avoir plusieurs microgrammes à la fin...

Et oui la PCR c'est un peu comme la réplication, en plus simple...

[kamor]

En gros la PCR c'est proche d'une réplication artificielle et imposée de l'ADN ?

C'est un détournement d'un processus naturel. L'artificiel est un mot que j'aime pas trop, on peut y mettre tout et n'importe quoi. Par contre imposé, oui vu qu'on ne met que nos amorces

Comment la synthèse des nouveaux brins parvient à trouver assez de nucléotides pour se faire ? On ajoute régulièrement des nucléotides pour alimenter la réaction ?

Si j'ai bien compris la question, tu auras ta réponse en regardant sur le site dont j'ai mis l'adresse la petite animation si bien faite.
La PCR est un processus de multiplication exponentielle. C'est à dire qu'au bout de 30 cycles, on aura théoriquement 1 milliard d'amplicons à partir d'un brin d'ADN.
Si tu parles des dNTP par contre, on les met en excès. Comme je l'ai dit en théorie, l'ampli est exponentielle tout au long de la manip, mais en fait elle ne l'est que pendant un certain nombre de cycles, après un des constituants vient à manquer et on obtient un plateau.

P.S.= il n'y a que quelques profs qui mordent, et c'est toujours plus intéressant pour eux d'avoir affaire à quelques élèves qui ont l'air assez motivés par le sujet pour venir poser des questions

[invite23b5ba7c]

Merci beaucoup à vous tous, ça m'a bien débloqué et fait gagner un temps précieux.

Pour ce qui est de poser mes questions au prof, celui qui nous fait ces cours n'est pas trop accessible, il fait son cours en amphi, puis reste 5min à la fin ( le temps de répondre à une ou deux questions grand max parmis tous les élèves agglutinés devant lui ^^ ) puis se sauve au CHU pour continuer sa journée.

Encore merci

[invite8a80b784]

j'ai un gros pb pour un exo, je voudrais m'exercer pour mon examen de demain mais je n'y arrive pourriez vous m'aider s'il vous plait ?

j'ai du mal avec les boites -35 et -10

[Htu]

Salut.

j

'ai du mal avec les boites -35 et -10

En quoi elles te dérangent?

[invite8a80b784]

je ne peux pas passer l'amorce au dessus ?

[invite8a80b784]

Si on peut passer au dessus des boits l'amorce antisens serait :
5' CAAGCTTGTAGCGCGC 3'


?

[invite8a80b784]

Normalement les boites -35 -10 sont les promoteurs et +1 origine de Réplication

Mais donc je ne voit pas où je dois commencer à placer l'amorce