DNAse est elle essentielle à l'extraction d'ARN (pour qPCR)

[cloclo69]

Bonjour,

Voilà j'ai besoin de votre aide, je suis étudiante M2 et j'ai du mal à extraire mes ARN.
Tout simplement car je précipite 2 fois et mon culot est transparent
Je fais une extraction trizol-bcp puis je précipite à l'isopropanol, puis à l'éthanol.Je resuspend dans de l'eau. Je traite à la Dnase Rq1-Buffer puis je reprécipite à l'isopropanol puis l'ethanol et hop mon culot est transparent, tout petit et je fais tout à l'aveuglette. Alors pour ceux qui sont expérimentés ça va tout seul mais moi je perds quelques fois mon culot.
Ma question étant, l'étape Rq1 Dnase est elle essentielle si on veut faire ensuite une RT, qPCR (surtout si nos rapports sont bons au Nanodrop)? Puis je traiter à la Rq1 juste avant de faire la RT et inactiver mon enzyme à 65° et ne pas reculoter après.
J'ai vu que du coup ça ajoutait du magnésium et qu'il fallait en tenir compte dans la réaction de RT.

Petite précision:Il est hors de question d'acheter du glycoblue.Mais quel en est vraiment son prix?

Merci de vos réponses
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[kamor]

Oui quand j'en faisais après une extraction phénol chloroforme (et oui c'est surement la pire manip de bio mol), le traitement DNase était fait après. donc je dirai que oui.

La concentration de MgCl2 impactera les deux réactions, la RT mais aussi la PCR.

Donner le prix d'un produit est difficile, il dépen de la remise que le commercial veut bien accorder à ton labo. Et là, tout est possible

[Flyingbike]

Pour la nécessité de la DNAse, ça n'est pas nécessaire avec le trizol et encore moins si les primers sont bien designés. Un contrôle négatif de RT avec chaque couple est suffisant pour la plupart des situations.

[piwi]

Suffit de prendre deux primer entre deux exons et ça permet la plupart du temps de pouvoir distinguer le transcrit du génomique. De plus, il faut faire gaffe aux DNases surtout si le lot traine dans un frigo depuis longtemps, elles sont parfois contaminées avec des RNases. Ca n'aide pas! ^_^
Le nanodrop est un spectro qui va distinguer les acides nucléiques (ARN + ADN) des protéines. Le fait que les rapports soient bons ne vous renseigne pas sur le ratio ARN/ADN. Ne prenez pas cela comme une référence de pureté de vos ARN.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[kamor]

Suffit de prendre deux primer entre deux exons et ça permet la plupart du temps de pouvoir distinguer le transcrit du génomique.

Et si on travaille sur des Procaryotes ?

[piwi]

On change de modèle ^_^
C'est pourtant simple!