Problème de ligation

[inviteb7901eb7]

Bonjour,

Ca fait deux semaines que je tente de faire une ligation entre pCLNCX et mon insert. J'ai coupé mon plasmide par HindIII et amplifié mon insert avec des amorces contenant le même site de restriction HindIII, la taille de mon insert est bonne; celle de mon plasmide aussi, il a bien été digéré car j'ai comparé le plasmide digéré ou non. J'ai testé 3 types de bactéries plus ou moins compétente, les top10, les DH5x les NEB5-alpha et je teste en parallèle à chaque fois une ligation de pCLNCx seul et une autre avec mon insert. Dans aucun des cas je n’ai obtenu de colonie.
J’ai également tenté différents temps de ligation, 4h à Température ambiante ou overnight à 4°c. Quel paramètre puis-je encore tester ou faire varier ?
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[invite3ef76603]

bonjour,
est- ce - que tu as procédé à une déphosphorylation de l'extrémité 5' de ton plasmide digérée? l'utilisation d'une phosphatase alcaline est necéssaire dans l'étape qui précède la ligation puisque tu utilises un seul enzyme de restriction... car au moment de ligation il va être plus facile à un plasmide de se recirculariser plutôt qu'intégrer une autre séquence..

[Yoyo]

Salut

Le probleme viens tres certainement du fait que ton produit PCR est mal coupé par HindIII (ca m'arrive tout le temps ce genre de probleme). Du coup impossible de le cloner.
LA seule solution trouver est de sous cloner ton fragment dans un plasmide (genre pBC-SK) à un site franc. C'est simple et rapide car tu as une selection bleu /banc. Ensuite tu ressors ton insert par HindIII et tu le clones dans ton plasmide final.
Ca peut paraitre plus long, mais ca prends pas plus d'une semaine, et au final on gagne souvent du temps!
YOyo

[inviteb7901eb7]

Pour Lady, Oui j'ai bien déphosphorylé pCLNCX et de façon efficace puisque même seul il ne ce recircularise pas.
Pour yoyo, exellente idée, mais c'est déjà fait... J'ai récupéré mon insert dans PCRTopo et j'arrive effectivement à récuperer mon insert de la bonne taille bien couper de façon certaine et aprés ligation je n'obtiend rien...


Merci tout de même pour les idées

[A voir en vidéo sur Futura]

[Yoyo]

salut

Refait le clonage à partir de ton fragment sorti de PCRTopo mais sans déphosphorylé ton plasmide. La CIP ou la shkink abime parfois les extrémités de l'ADN rendant impossible toute ligation.
Ca me fait penser, si tu utilises la CIP, tu fais bien un phénol/chloroforme apres?

YOyo

[inviteb7901eb7]

Merci, même pas eu besoin. Sa à marché.
J'ai refais toute la manip avec un nouveau pCLNCX que j'ai digeré et déphosphorilé et un nouveau fragment luc, j'ai également pris la même ligase mais un nouvel alicot non ouvert.
Je penc que la ligase avait du être décongelé et recongelé trop souvent.

[Yoyo]

Super c'est génial si ca a marché!
Merci de nous en avoir tenu informé

YOyo