Problème de clonage

[invite6b63a5ae]

Bonjour,
J'essaie en vain de cloner en quantité suffisante un fragment ADN pour mon stage de M2. Le soucis est que lors de mon clonage (préculture et culture), la DO est bonne mais quand on dose la quantité d'ADN plasmidique, elle est très faible et très variable (de 10 à 300 ng/µL).
Mon maitre de stage a d'abord pensé à une possible contamination des cultures mais les manip sur milieux LB avec différents antibiotiques ont permis de rejeter cette hypothèse.
Il eut entendu parler de repiquer une culture liquide ou un glycérol stock sur boîte, est ce que quelqu'un saurait faire ?
J'ai grand besoin d'aide sinon je dois reprendre tout depuis le début.
Merci d'avance
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[invite2fb83916]

Je ne comprends pas vraiment ta question... Tu voudrais étaler sur boite quelques microlitres de ta culture?
Concernant ton rendement, comment fais-tu ton extraction? Tu utilises un kit?

[invite6b63a5ae]

Je souhaite faire de la transcription in vitro et j'utilise un kit de midi-préparation pour extraire l'ADN plasmidique
Mon maitre de stage a entendu parler d'une technique pour mettre en culture sur boite une culture liquide mais il ne sait pas comment.
A moins que tu aies une meilleure idée pour que je puisse avoir un rendement meilleur.

[invite2fb83916]

Si ta DO est correcte et que tu n'as pas de contaminations il faudrait peut être deja voir comment améliorer l'extraction? En général dans les kits tu peux modifier les volumes selon si tu es en high copy ou low copy... J'essaierais avec les conditions de low copy. Ensuite à l'étape d'élution, je sais que pour améliorer le rendement quand j'ai des extractions un peu difficiles je chauffe le tampon d'élution à 70°C 15 minutes avant de l'appliquer... il y a plein de petits trucs comme ça

Pour ce qui est de la culture liquide dans une boite, jamais entendu parler...

Good luck!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6b63a5ae]

Je vais en parler à mon maitre de stage
En tout cas merci