milieu de culture

[Ali.Z]

Bonjour,

je travail sur l'extraction de l'ADN à partir des bactéries (LES STREPROMYCES),mais avant tous il me faut un bon rendement de mycélium or le culture que j'ai fait on milieu ISP2 liquide on sporulé donc j'ai tjrs de spore dans ma culture
je cherche un milieu de culture liquide pour cultivé des streptomyces afin d'avoir un bon rendement de mycélium avec le moin de spore possible (si possible aucune sporulation)

Merci d'avance
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[Ali.Z]

tjrs pas de réponse :s

[noir_ecaille]

Peut-être faut-il raccourcir le temps d'incubation afin de n'avoir que la phase transitoire du cycle des Streptomyces.

[Ali.Z]

oui mais il ne murit tjrs pas qd je raccourci le temps d'incubation
d'apres mes recherhe sur google j'ai trouvé qu'il faut ajouté du saccharose au milieu ISP2 mais c a 34% c trooooop (je trouve)

[A voir en vidéo sur Futura]

[noir_ecaille]

Tentez l'expérience à 34%. Peut-être que votre culture passe plus vite en hyphe parce que justement elle n'a pas assez de sources carbonées -- d'où un déclenchement du recyclage des filaments qui débouche sur la sporulation.

[Ali.Z]

oui c ce que j'ai dis mais dans la bibliographie c les milieu ISP utilisé sans additionnement de rien
oui je v la tenter j'ai f une préculture sur ISP4 liquide pour 48h et apres je v le metre dans milieu ISP2 liquide + saccharose a 10% voire les resultats apres 48h
j'espere que j'aurrai du mycelium afin d'extraire l'ADN puisque les spores il faut une sonication or c risqué la sonication :s
bin espèrent le mieu
Merci pour ta reponce noir_ecaille
vous n'aurriez pas un protocole d'extraction d'ADN genomique ou plasmidique pour les streptomyces ???!

[Flyingbike]

bonsoir,

Ali.Z, merci de faire un petit effort de rédaction qui facilitera la lecture et donc l'obtention de réponses à vos questions.
Je rappelle le point 13 de la charte :

13. Respectez les lecteurs du forum, n'écrivez pas vos messages en style SMS ou phonétique. Utilisez la fonction "prévisualisation" pour vous relire et limiter les fautes d'orthographe. Evitez les majuscules pour attirer l'attention des lecteurs.

Cordialement

[noir_ecaille]

Brut de fonderie, je n'ai rien sous la main.

De mon crû je dirais :
- adjonction de lysozyme pour se débarrasser du peptidoglycane
- centrifugation et élimination du surnageant
- re-suspension du culot en eau distillée tamponnée ou non
- adjonction de CaCl₂ ou MgCl₂ pour neutraliser les DNAse
- congélation du culot ou ajout d'une goutte de nitrogène liquide puis décongélation
- adjonction d'un détergent ou surfactant
- adjonction d'une protéase pour se débarrasser des histones et du reste
- précipitation de l'ADN à l'éthanol

Par contre vous aurez l'ADN génomique et plasmidique.

Pour l'ADN plasmidique, pas de protéase. À la place, précipitation par saturation alcaline. Centrifugation, conservation du surnageant et élimination du culot. Enfin précipitation à l'éthanol.

[Ali.Z]

Merci pour les information noir_ecaille;
si vous auriez un protocole bien traité avec des valeurs j'aimerai bien que vous le partagiez ça m'aidera beaucoup
(pour information se sont des bacterie gram + leur paroi est bien différente du gram - comme vous le saviez,dans mon protocole ya le phenol-chlorophorme mais les valeurs change d'un article a autre , je ne sais pas trop quoi faire)

[noir_ecaille]

Vous m'en demandez beaucoup ^^;

Il faudrait effectuer quelques calculs...

A l'aide d'un étalon de turbidité optique peut-être, en déduire grâce à une gamme de cultures quelle quantité de milieu ISP2 utiliser avec quel %age de saccharose + le temps d'incubation. Le plus important c'est de garder les streptomyces en phase de croissance végétative, donc proposer un milieu assez riche en substrats. Le reste doit pouvoir s'effectuer en utilisant un protocole d'extraction d'ADN lambda et en adaptant un peu.

Ou alors dénicher un protocole tout prêt, mais j'avoue ne pas trouver.

[Ali.Z]

Merci et excusé moi si j'ai trop exagéré oui pour la croissance comme je vous es dit toute a l'heure j'ai mis une préculture en ISP4 liquide (2ml) laissé incubé a 30°C pendant 48h avec agitation et après la mettre dans un milieu ISP2 + 10% saccharose et incubé a 30°C pour 48h avec agitation

si vous pourriez faire un saut sur cette discutions et m’éclaircir j'ai mis le protocole dans la 2eme page Merci d'avance
http://forums.futura-sciences.com/bi...tion-dadn.html