KACEM Nadia Sandra
Bonsoir,
je fais des extractions ARN au trizol à partir de cals, mais je rencontre des soucis quand à la qualité de l'ARN !!
les 18S et les 25S apparaissent mais avec une faible intensité , et j'ai une bandes en bas en sous du marqueur qui parait très intense ? est ce qu'il s'agit de contaminations ou d'ADN? j'ai essayer de faire un traitement DNase la bande disparaît mais les 18 et 25S sont presque invisible ,
voici le protocole que je suis entraîne de suivre merci de m'éclairer:
1. Broyage 1000 µL de trizol pour 50 à 100mg de cals
2. Laisser 5 minutes à température ambiante
3. Ajouter 400 µL de chloroforme.
4. Vortexer 15 secondes et laisser reposer à température ambiante de 7 minutes.
5. Centrifugation 15 minutes à 12 000g
6. Transférer (500µl) de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube et ajouter 500µl d'isopropanol. Mélanger à la main doucement pendant 5 minutes.
7. Centrifugation 8 minutes à 4°C à 12 000g
8. Laver le culot avec 1 mL d'éthanol 75%
9. Centrifugation 5 minutes à 4°C à 7 500g
10. Après séchage à 37C° resuspendre dans 25 µL d’H2O DEPC
11. Centrifugation 10 secondes, voterx, Centrifugation 10 seconde.
12. Quantification au nanodrop.
-----