Bonjour à tous,
Je suis en plein rapport de T.P. et j'ai pas mal de doute sur la méthode que j'ai employé puisque c'est la première fois qu'on calcule une activité enzymatique:
L'expérience était de suivre la cinétique d'une fraction Fo (le blanc d'oeuf) diluée au 1/10ème,et d'une fraction E1 (obtenue après purification du lysozyme par chromatographie) diluée au 1/2:
Pour cela on prépare deux tubes: -tube 3: 2.9ml de microccocus (une bactérie gram- sensible au lysozyme) + 0.1ml de Fo diluée au 1/10ème.
-tube 4 2.9ml de microccocus + 0.1ml de E1 diluée au 1/2.
On mesure l'absorbance a DO(450nm) et on obtient une courbe de fonction affine décroissante.
On nous demande de calculer l'activité enzymatique, l'activité totale et l'activité spécifique.
On nous dit que l'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui provoque une diminution de 0.001 unités d'absorbance à 450nm en une minute.
La différence de 1 à 2 minutes est de 0.035 unités d'absorbance.
Je trouve donc pour Fo diluée: A(E)= 35 U/ml
Donc pour Fo non diluée: A(E)= 350 U/ml
D'après une dosage de Bradford je sais que [Fo]= 2.42 mg/ml
Soit x(tube3) la quantité de protéine dans le tube3 en mg
D'où x(tube3)= (([Fo]/10)*0.1) = 2.421.10^-3 mg
Calcul de l'activité totale: At = A(E) * Vt (avec Vt = 3ml, volume total)
= 350 * 3 = 1050U
Calcul de l'activité spécifique As = At / x(tube3) = 1050 / 2.421.10^-3 = 4337 U/mg
Mes doutes sont plus sur la méthode, surtout si il ne faut pas non plus multiplier par le facteur de dilution la quantité de protéine, comme pour trouver l'activité enzymatique de Fo non diluée, afin de trouver le reste.
Aussi qu'est ce que l'activité catalytique, on nous demande de la déduire d'après la courbe d'absorbance en fonction du temps en UI lysozyme. Est-ce une sorte de vitesse de réaction en Abs/min?
Je vous remercie d'avance, cordialement.
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