TP activité de la phosphoénol pyruvate carboxylase, calcul vitesse initiale

[Wass06]

Bonjour,

J'ai un compte rendu à faire sur la comparaison de l'activité de la PEPcase (phosphoénol pyruvate carboxylase) des plantes à métabolisme photosynthétique de type C3 et C4 (respectivement l'épinard et le sorgho).

J'aurais besoin d'un peu d'aide pour une des questions ...

On nous demande de déterminer graphiquement la vitesse initiale de la réaction des deux plantes avec et sans PEP.
J'obtiens deux courbes en traçant la DO en fonction du temps:
pour l'épinard avec et sans PEP, j'ai une courbe stagnante et pour le sorgho j'obtiens au départ une courbe stagnante puis après l'ajout du PEP une droite linéaire descendante.

Pour déterminer la vitesse initiale je fais delta(DO)/delta(temps) mais du coup j'obtiens une vitesse en min-1 puisque la DO n'a pas d'unité, est-ce normal ?

Par ailleurs on nous demande de prendre en considération la vitesse de réaction en absence de PEP, en absence de PEP j'ai une vitesse initiale proche de 0 alors comment fait-on pour prendre en considération cette vitesse ?

Merci d'avance des vos réponses !!
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[Flyingbike]

la DO n'a pas d'unités, certes, mais la loi de Beer-Lambert vous permet de déterminer la vitesse d'apparition du produit (ou de disparition du substrat), par la relation : A (DO) = e (coeff d'extinction molaire de votre composé) x L (longueur du trajet optique) x C (concentration du composé)

quant à la vitesse de réaction en absence de PEP, j'imagine que c'est une sorte de bruit de fond qui vous permettrait de prendre en compte les variations de DO qui seraient indépendantes de la réaction enzymatique.

Faudrait préciser ce que vous avez mesuré en réalité...

[Wass06]

Alors on a mesuré à 340nm la disparition du NADH...
Ici on fait une mesure indirecte de l'activité de PEPcase par mesure de l'activité de la malate déshydrogénase qui utilise l'oxydation de NADH donc on mesure la cinétique d'oxydation du NADH.

En utilisant la formule delta(DO)/delta(temps) j'ai:

DO(340nm)= 0,929 nm pour t=0 min
DO(340nm)= 0535 nm pour t= 2min

J'obtiens (en valeur absolue) une vitesse de 0,197 min-1. Donc du coup je garde cette valeur avec cette unité ? C'est pas faux ?

Et comment fait t-on pour prendre en compte ce bruit de fond ?

Merci de votre réponse !

[Flyingbike]

bah non, je viens de vous dire qu'a partir du ∆Do on peut calculer un ∆C donc une vitesse...

et le bruit de fond, il suffit de le soustraire

[A voir en vidéo sur Futura]

[Wass06]

Ah d'accord,

je pensais faire ça dès le début mais j'avais un doute psk la question d'après demande de calculer l'activité de la PEPcase en nmol par minute.

Du coup je vais calculer la vitesse en concentration (micromol/L) par minute et je convertirai cette concentration en nmol pour avoir l'activité du NADH en nmol/min et donc avoir celle de la PEPcase !

Est-ce que mon raisonnement vous paraît bon ?

Merci !

[Flyingbike]

oui a part que le NADH n'a pas d'activité

[Wass06]

Merci,

Alors je suis de nouveau bloquée, on nous demande un peu plus loin de calculer l'activité spécifique de la PEPcarboxylase (en nmoles de PEPcarboxylé par min et par mg de protéines).

J'ai calculé au préalable avec une gamme étalon de la BSA la concentration protéique pour chacune des deux espèces végétales mais je comprend pas ce qu'il faut faire pour calculer l'activité spécifique de la PEPcase ?

En quoi diffère-t-elle de l'activité (simple) la PEPcase ?

[Flyingbike]

L'activité spécifique est ramenée à la quantité d'enzyme

[Wass06]

Si j'ai bien compris:

Ayant calculé le nombre de mole de PEPcarboxylé par min et ayant calculer la concentration protéique (extrait enzymatique) pour chaque espèce végétale, pour avoir l'activité spécifique de la PEPcarboxylase je dois juste diviser le nombre de mole de PEP caboxylé par min PAR la masse des extraits protéiques ?

Merci

[Flyingbike]

oui, la différence entre les deux activités tient dans le "par mg de protéine"