PCR RFLP conventionelle

[Zouhir1]

Bonjour tout le monde
s'il vous plait aidez moi à transformer les concentrations d'un mix de pcr à partir du Mol en volume initiale
Sachant que notre volume final sera 50 ul donc qu'il est le volume initial de la MgCl2 à prendre si la concentration final est 50 mM ET c INITIALE = la concentration fournie par le tube de stock EST 50 mM
j'ai utilisé la relation : Ci*Vi = Cf*Vf
le problème c'est que j'ai trouvé après l'application de cette technique vi = 50ul et mon volume FINALE 50 ul
est ce que vous avez une autre méthode ?
Et pour les primers nous avons 100 pmol comme Cf mais le tube de stock ne donne aucune information cancernant la ci
Merci à vos aides
Zouhir1
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[Flyingbike]

si votre stock est a 50mM et que votre finale est a 50mM, il est normal que Vi = Vf, et que vu que vous ne deviez pas diluer, vous n'avez de place que pour votre MgCl2 !
Vous avez une erreur dans Cf qui est plus autour de 5mM en temps normal... A vérifier !

Pour les amorces, si elles sont liquides il y a une concentration notée quelque part (sur le tube ou sur le rapport de synthèse) et si elles sont lyophilisées, il faut rajouter de l'eau en fonction de la quantité synthétisée (sur le rapport de synthèse également)

[Zouhir1]

OUI après la confirmation nous avons 50 mM de MgCl2
pour les primers je n'ai pas bien saisie ce que vous avez écrit essayez s'il vous plait de me donner la méthode générale
Merci à vous

[Zouhir1]

Une autre question s'il vous plait
Le protocole par lequel je travaille utilise 6ul du buffer qui contient 30 mM de MgCl2 et notre volume final c'est 50 mM
mais pour le labo dans lequel je suis en stage contient un buffer (tampon) sans MgCl2 alors comment je pourrais faire pour calculer le volume de MgCl2 à pipter sachant que la concentration de MgCl2 founie par le stock = 50 mM

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

C'est pas compliqué : vous prenez 6µL que vous mettez dans 50µL, le facteur de dilution est donc de 50/6 = 8,33
La concentration est donc divisée par 8,33 : 30/8,33 = 3,6mM final

En faisant la même chose a l'envers, vous pouvez calculer combien prélever de votre solution a 50mM pour arriver a une concentration de 3,6mM.


Pour la question d'avant, je ne peux pas vous en dire plus. Il vous FAUT la concentration initiale de vos amorces, et il n'y a que vous qui puissiez l'avoir. Donc regardez sur le tube, ou sur le document qui vient avec les tubes (papier, ou maintenant en pdf), si vous ne l'avez pas demandez a la personne qui a commandé la synthèse !

[Zouhir1]

Bonjour Monsieur Madame Flyingbike
Je vous remercier chaleureusement pour l'aide
j'ai une autre question concernant les smears, pourriez vous me donner les causes de ces derniers?
Merci à vous

[Flyingbike]

Monsieur

Dans quel contexte ? on peut avoir des "smears" avec de très (trop) grandes quantités de matériel, mais aussi lorsqu'on a des acides nucléiques de toute sorte (comprendre de toutes longueurs), qui donnent un signal continu sur une large gamme. Ça peut etre des produits de PCR non finis, des acides nucléiques dégradés, etc.

[Zouhir1]

Merci bcq Mr Flyingbike,
pour le moment je suis bloqué. on a essayé ce jour à nouveaux mais cette fois-ci ni smears ni traces d'adn,demain on va essayer de changer le protocole complétement en tout cas je vous remercier encore une fois pour vos réponses que j'ai bien appréciées.Si j'aurais une questions je le poserai sur le forum à nouveau et essayé s'il vous plait de me donner les détails des détails parce que je suis qu'un débutant dans ce domaine

[Flyingbike]

Bon courageSi vous avez d'autres questions n'hésitez pas a ouvrir une nouvelle discussion

[Zouhir1]

Merci bcq je vous en prie.