Important! besoin d'aide pour extraction ARN sur cellules de cerveau! pleaseeee

[Megchouk75]

Bonjour à tous,

Je suis nouvelle sur le forum mais j'espère vraiment trouver de l'aide ici. Cela fait plusieurs semaines que je cherche un protocole efficace pour extraire l'ARNt de cellules musculaire vasculaire lisses provenant de tissus cérébral (CMLV-B)...

Je cherche à faire des RT-qPCR mais il me faudrait au grand minimum 10ng/uL pour travailler car je ne veux voir que 23 gènes maximum incluant les contrôles. Hors, après deux méthodes d'extraction différentes, je n'arrive toujours pas à avoir un bon ration et une quantité suffisante.

Pour info, je travail sur du tissus plus petit qu'une aorte de rat - Congélé à -20°C depuis deux mois maintenant (sans RNA later) et ces échantillons étaient stockés à -80°C depuis 3 ans environs par une étudiante du laboratoire. Aujourd'hui je dois prendre la suite mais le kit reliaPrep de Promega ne me permet pas de travailler convenablement après (et encore, souvent je ne récupère rien du tout).

Je suis actuellement en train d'essayé une méthode au trizol/ phénol-chloroforme (sur des échantillons de coeur et d'aorte de souris afin de mettre au point la technique). Auriez-vous des idées et étapes importantes à faire primordialement afin de récupérer au maximum d'arn via mes échantillons de CMLV-B?


Merci à ceux qui prendront le temps de me répondre ...
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[Flyingbike]

ARNt ? vous voulez des messagers non ?


comment broyez vous le tissu ? quelle est la quantité de tissu initiale (en mg ?)

pourquoi ne pas utiliser un kit pour petites quantités (qiagen, stratagene, etc...)


un exemple de quantité récupérée ? et de concentration ?

[Megchouk75]

ARNt ? vous voulez des messagers non ? -> oui en effet en finalité je veux des messagers


comment broyez vous le tissu ? quelle est la quantité de tissu initiale (en mg ?) ->Boryage avec ultra-turax 2x10secondes 1min de repos entre deux broyage et fait dans la glace (seule machine disponible dans nos laboratoires), quantité de tissus initiale inférieure à 0.5mg , on voit à peine le tissus. Pour vous rendre compte, il s'agit de l'équivalent de 5uL en terme d'épaisseur et encore je suis généreuse.

pourquoi ne pas utiliser un kit pour petites quantités (qiagen, stratagene, etc...) ->le laboratoire utilise un kit reliaPrep RNA cell mini prep system de chez Promega depuis des années et n'utilise que celui-ci. J'ai déjà demandé pour un autre kit style qiagen (je l'utilisais dans un autre laboratoire sur du coeur). Mais cause de budget, le laboratoire ne peux se permettre d'acheté un kit sans être certain que celui-ci fonctionne au niveau du rendement.


un exemple de quantité récupérée ? et de concentration ? Les quantités que je récupère jusque maintenant avec le kit sont de l'ordre de 3 à 10ng/uL dans 20uL selon les échantillons (ce qui est très juste pour nos RT et qPCR derrière.. on à pas intérêt à se planter après...). Toutefois, j'ai comparé l'utilisation du kit et la technique au trizol chloroforme sur un morceau de coeur de souris (le même coeur que j'ai coupé de manière équivalente avec 30mg de tissus environs) et j'obtiens , 300ng/uL dans 20uL avec le kit et 860ng/uL dans 40uL avec la technique au trizol.. le soucis c'est que sur des morceaux plus petits j'ai peur que tout soit contaminé avec les restes de phénol chloroforme... Je dois essayé cette technique aujourd'hui sur un tissus d'intérêt (contrôle) voir ce que j'obtiens et si je peux récupérer un peu plus.. sinon , est-ce qu'une amplification avant / après Rt serait possible pour doublé au minimum la quantité avant de faire la qPCR ciblée? je ne m'y connais pas trop pour la suite..

[Flyingbike]

Je ne connais pas votre kit mais pas de raison qu'il ne soit pas bon...

Pour la lyse, vous ne perdez pas dejà du matériel dans la tête du turrax ? Si le tissu n'est pas trop solide il y a peut être moyen de faire plus rentable, par exemple un piston manuel ou des billes ?

En quantité effectivement c'est peu. Pour le Phénol chloroforme, vous pourrez avoir un meilleur rendement mais un matériel moins spécifique ou moins propre. Il faut au moins faire une extraction chloroforme seul pour enlever le reste de phénol (le chloroforme est tres volatil)

Peut être ajouter du glycogène au moment de la précipitation pour ne pas travailler à l'aveugle ?

Ensuite, pour l'amplification, non vous ne pouvez pas, a moins de perdre la quantitivité de la manip !

[A voir en vidéo sur Futura]