Bonjour,
Je suis en L2 et en TP d'enzymo nous avons réalisé une purification de la beta-gal d'E. coli par chromatographie échangeuse d'anion (résine DEAE) et nous avons réaliser 2 tests qualitatifs sur une plaque de porcelaine avec 12 puits pour voir si l'étape de purification a été efficace :
(je copie colle ce que j'ai écris dans mon compte rendu et on dispose d'un extrait bactérien qui a subit lyse membranaire et dialyse donc dans l'extrait on a que des protéines)
On charge la colonne avec de l'extrait bactérien
1) Détection de la beta-gal
On sait que la β-galactosidase hydrolyse l’ONPG qui permet de libérer de l’ONP de couleur jaune. Nous pouvons donc déposer 100 µL d’ONPG à 3.10-3 M dans chaque puits et y ajouter 20 µL d’une fraction dans l’ordre de sortie de la colonne. On mélange ensuite avec le cône du Pipetman et on vérifie s’il y a apparition d’une coloration jaune traduisant la formation d’ONP et donc la présence de la β-galactosidase.
2) Détection des protéines pourquoi faire un test de détection des protéines ?
On utilise du bleu de Coomassie (réactif de Bradford – RB) qui se colore en bleu lorsqu’il est lié aux protéines. On dépose 200 µL de RB (préalablement dilué au 1/5 dans de l’eau distillée) dans chaque puits et on y ajoute 20 µL d’une fraction dans l’ordre de sortie de la colonne. On mélange avec le cône du Pipetman et on note l’intensité de la coloration caractéristique du nombre de molécule de bleu de Comassie liées avec les protéines.
Resultats obtenus :
1) On trouve de la β-galactosidase principalement dans la fraction 9. Théoriquement et comme dit précédemment, l’enzyme se lie très fortement à la résine et la solution permettant de décrocher l’enzyme de la colonne était une solution de Tris-HCL 20mM, pH 8, NaCl 500 mM ; solution utilisée pour les fractions 8, 9, et 10. On peut donc dire que notre fraction 9 de forte intensité de coloration jaune est cohérente avec les fractions théoriques attendues. Cette fraction 9 composera donc notre Pool II.
2)
C'est ici que je bloque un peu... pour les fractions 1, 2, et 2 j'ai pas de coloration bleu (ça veut dire que j'ai pas de protéine ? mais bizard parce-que je suis censé avoir des protéines chargées + et neutres... donc je vois pas trop comment interpréter ce résultat).
Pour la fraction 5, 6 j'ai une coloration identique à mon témoin positif (extrait bactérien) et puis pour la fraction 8 et 9 peu de coloration et aucune pour la fraction 10.
Je serai tenté de dire que dans les fractions issues de l'extrait bactérien nous n'avons pas de protéines chargées positivement et/ou neutres ainsi que dire que la béta-gal est la dernière protéine a s'être retirer de la colonne (car pas de coloration bleu dans la fraction 10 après ajout du bleu de coomassie) mais je trouve que cette conclusion est très vulgaire et je doute que ce soit cela...
Merci pour vos éclaircissements..
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