Activité spécifique de la phosphatase alcaline

[tily]

Bonsoir à tous,

j'ai fait un TP sur l'activité d’une phosphatase alcaline

on a tout d'abord réalisé une gamme étalon avec des concentrations différentes en PNP (produit que l'on obtient après hydrolyse du PNPP par l'enzyme) on note les absorbances et on a une droite d'étalonnage
en suite, on réalise 2 séries de tubes (témoins et l'autre dans lequel on va mettre l'enzyme) avec 1ml de substrat PNPP et du tampon que l'on met au bain marie a 37°c pourquoi mettre à incuber pendant plusieurs minutes? le prof a dit que c'était pour obtenir des conditions optimales mais à quoi ça sert si on a toujours pas mis l'enzyme? pourquoi attendre plusieurs minutes?

ensuite, on incorpore l'enzyme (0.5 ml) et toutes les 5 minutes on prélève 1ML pour les mettre dans des tubes (avec dedans 1ML de soude) pour ensuite mesurer l'absorbance (=lien direct avec la concentration en produit PNP) mais pourquoi prenons nous 1ML? car il faut autant de soude que solution pour être sur de stopper entièrement la réaction?
on demande également la masse d'enzyme présente dans chaque prélèvement? je ne pense pas que ce soit 0.5 ml mais comment on fait pour déterminer ça?

une fois toutes les mesures de DO prises, on peut, grâce a la droite étalon, savoir la concentration en PNP des tubes
on obtient alors une courbe (PNP) en fonction du temps (temps où l'on a fait chaque prélèvement)
on peut alors faire la tangente et obtenir Vi puis on nous demande de calculer l'activité enzymatique et l'activité spécifique là je ne sais pas du tout comment faire...

merci pour votre aide
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[moco]

Bonjour,
Tu n'es pas bien clair !
Une masse ne s'exprime pas en millilitre. Quelle est la concentration en enzyme dans ta prise de 0.5 mL ? Quelle est la concentration de cette soude ? Et c'est quoi PNP et PNPP ?

[tily]

Bonjour,

le PNPP c'est le paranitrophénylphosphate et le PNP c'est paranitrophénol

voici les réactifs dans mon énoncé j'avais oublié de le mettre - Tampon glycine-NaOH (A) : glycine 100 mM pH 10,4 (ajusté avec NaOH) contenant ZnCl2 1 mM.
- Substrat : pNPP (371,15 g.mol-1) 2,5 mM préparé dans du tampon A.
- Enzyme : 0,2 unité d’enzyme/ml de solution de MgCl2 1 mM froid. La concentration en protéine est de 200 g/ml.
- NaOH 0,2 N
- Solution de pNP (139,11 g.mol-1) à 20 mg.l–1 pour la gamme d’étalonnage. - MgCl2 1 mM


on ajoute plus précisément 0.5 ml de la solution enzymatique dans les tubes pour le dosage (et O.5ml de la solution de mgcl2 dans les tubes témoins), en plus du PNPP et du tampon. Toutes les 5 minutes, on prélève 1 ML de cette solution qu'on place dans des tubes a essais (contenant de la soude) pour ensuite au spectro mesurer l'absorbance (et donc mesurer indirectement la concentration de PNP produit)
et on demande quelle est la masse de chaque enzyme dans chaque prélèvement mais je ne vois pas... merci

[moco]

Est-ce que je rêve ? Tu dis que la concentration en protéine est de 200 g/mL. Vous êtes très forts. Vous arrivez à mettre 200 grammes de protéine dans de l'eau de manière à obtenir 1 mL de solution. Votre millilitre, qui d'habitude pèse environ 1 gramme, pèsera alors au moins 200 g !!!
De toute façon, si vous voulez résoudre votre problème, il faudra connaître la masse d'une unité d'enzyme.

[A voir en vidéo sur Futura]