PCR et séquençage

[Igore]

Bonjour,
j'ai un exercice en Biologie moléculaire que je ne comprends vraiment pas et qui est crucial pour ce chapitre. Le voici:

QUESTIONS:
1. L’ADN génomique d’une bactérie marine récemment isolée de sédiments a été extrait et purifié. Ce génome a ensuite été soumis à un séquençage suivant le méthode de Sanger.

a) Résumer en vous appuyant sur un schéma le principe de la méthode de séquençage utilisée.

Ce séquençage a mis en évidence la présence, au sein du génome bactérien, d’un gène C codant visiblement pour une enzyme de dégradation de la chitine (polysaccharide de constitution des carapaces des crustacés, des coquilles de céphalopodes,…).
Une équipe de chercheur souhaite produire de manière recombinante cette enzyme dénommée . Pour cela et en utilisant un couple d’amorces adaptées, une première étape d’amplification par PCR du gène C est entreprise. La séquence nucléotidique partielle du gène C se trouve en annexe 1.

b) Quelles amorces utiliseriez-vous pour amplifier le gène C en sachant que le clonage dans le vecteur d’expression sera réalisé en utilisant l’enzyme de restriction EcoRI
(taille des amorces attendues : 20 nucléotides; séquence EcoRI : GAATTC) ?

2. Le produit de PCR obtenu a été digéré et ligué dans un vecteur d’expression de 3,3 kb (pPICZA). Pour vérifier le clonage, différentes digestions ont été réalisées :

a) Les vecteurs pPICZA recombinant et non recombinant ont été digérés par les enzymes de restriction EcoRI ou PstEII. Compléter le gel d’agarose présenté en annexe 2 en dessinant pour chaque piste (1 à 4) les bandes correspondantes aux profils de restriction attendus.

b) Question bonus : Le vecteur recombinant a ensuite été digéré par les deux enzymes simultanément. Compléter le gel d’agarose (piste 5).


Mes réponses :
Pour la 1)a), pas de problème.

Pour la 1)b), j'utiliserai les amorces 5' ATGAGCATTTGTTATCACGA 3' et 3' AATAAGAAGGAAACGAAAGT 5'

C'est pour la 2)a) que ça se complique... Si quelqu'un peut m'expliquer

Merci d'avance !
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[Flyingbike]

1b : prenez l'habitude de donner les séquences en 5' 3', par convention.

mais c'est incorrect, l'amorce antisens doit être sur l'autre brin d'ADN, donc complémentaire au brin dont est complémentaire l'amorce sens.

2) vous ouvrez votre vecteur avec ecoR1, vous mettez l'insert aussi digéré par ecoR1. Commencez par dessiner le résultat du clonage(comme ce qu'on voit dans l'annexe 2, avec les sites de restriction et les tailles). On y verra plus clair !

[Igore]

A)b) Donc on a 5' ATGAGCATTTGTTATCACGA 3' et 5'TGAAAGCAAAGGAAGAATAA 3' ??

2)
On doit bien rajouter 1 chaque fois sur l'insert c'est bien ça?

[Flyingbike]

1b)
non, encore une fois les deux amorces sont prises sur le même brin. Il ne faut pas oublier que votre matrice est de l'ADN double brin, et que pour amplifier votre gène il faut une amorce complémentaire de chaque brin. Regardez ici :


2)
bien, maintenant que donnerait une digestion par EcoRI et ou PstEII sur chacun de vos deux plasmides ? C'est à dire quelle est la taille des fragments attendus ?
NB : la taille du plasmide recombinant n'est plus la bonne !

[A voir en vidéo sur Futura]

[Igore]

1)b) si j'ai bien compris, on a 5' ATGAGCATTTGTTATCACGA 3' et 5' TTATTCTTCCTTTGCTTTCA 3'

2) Taille plasmide recombinant : 4.1 kb

Je ne vois pas comment déterminer la taille des fragments attendus...

[Flyingbike]

1b) essayez de coller ces amorces a votre brin, en faisant attention au sens/antisens, et faites une PCR virtuelle comme en #4. En n'oubliant pas que la polymérase travaille en 5'->3'.. Est ce que c'est bon ?

2)vous avez un lacet de 3,3m avec des points de coupure disposés comme sur votre carte. On prend des ciseaux EcoRI et/ou PstEII pour le couper, quelle est la taille des morceaux de lacet obtenus ?

[Igore]

1)b) Oui, c'est bon, en sachant que l'amorce sens est 5' ATGAGCATTTGTTATCACGA 3 et l'amorce anti-sens est 5' ACTTTCGTTTCCTTCTTATT 3'

2) Taille des morceaux obtenus :

-avec EcoRI : 1019/?

-avec PstEII : 2037/?

Comment savoir quelle taille font les deux autres fragments (les deux plus grands ) ? Il me manque une donnée qui m'a échappé :/

[Flyingbike]

pourtant elle est devant vos yeux : la taille totale du plasmide

n'oubliez pas que juste avant le 1 il y'a 3300 (ou 3300 + 1018 pour le recombinant)

si on enlève 1,019m au lacet, c'est facile de voir ce qu'il reste.

[Igore]

En sachant que le recombinant = 4318 , on obtient :

-avec EcoRI : 1019/3299

-avec PstEII : 2037/2281

Est-cela?

[Flyingbike]

oui

il suffit de faire pareil pour répondre à la question 2, vous aurez la taille des fragments demandés et il suffira de les représenter sur le gel.

[Igore]

Merci beaucoup

[Igore]

J'ai une question : pourquoi ai-je changé Hind III et Bam HI de position alors que je met mon insert après ces deux sites ?

Je pense que mon post du 02/11/2016 - 16h08 est faux ... Du coup, tout l'exercice est faux ...

[Flyingbike]

VOus le mettez avant. Enfin dans un plasmide circulaire ca n'a pas d'importance, meme si vous changez l'origine de la numérotation, les digestions produiront les mêmes fragments ! votre carte est bonne selon moi.

[Igore]

En fait, ce sont 2 exercices légerement différents, seuls les enzymes de restriction utilisées sont différentes.

Je dis que c'est faux car nous avons fait la correction de l'exercice en cours et cela n'avait rien à voir avec ce que j'ai fais. J'ai demandé à la prof si on devait changer de position les HindIII et Pst EII (et non BamHI), elle m'a dit que non, vu que l'insert est après tous ces sites... Je ne comprends plus rien

[Flyingbike]

c'est une histoire d'origine. Le site EcoRI est en 1 mais lors du clonage il est "coupé en 2" et près ligation on retrouve 2 sites de part et d'autre de l'insert. Vérifiez, mais normalement la taille des fragments est la même dans les deux cas.

[Igore]

Mais du coup ma question reste la même : comment compléter le gel d'agarose? Je ne sais pas quoi mettre pour le vecteur non recombiant dans le cas des 2 enzymes (cas de l'exercice que j'avais posté précédemment)

[Flyingbike]

vous voulez dire avec un seul site de coupure ? ben le plasmide reste entier, sauf qu'il est linéaire !

[Igore]

Je ne veux pas trop vous en demander mais svp pouvez-vous compléter le gel d'agarose (en annexe )

[Igore]

Qu'obtient-on dans le cas où la digestion est faite par les 2 enzymes?

[Flyingbike]

ben si vous coupez a chaque fois que vous voyez un site correspondant, qu'est ce que ça peut donner ? Pensez au coup du lacet et des ciseaux, c'est vraiment pas compliqué.

[Igore]

Piste 1 : 3300

Piste 2 : 3300

Piste 3 : 1019/3299

Piste 4 : 2037/2281

Piste 5: 881/138/1899/1400


Est-ça?

[Igore]

Petite erreur :
Piste 3 : 1018/3300

Piste 4 : 2038/2280

Piste 5:1900/1400/880/138

[Flyingbike]

oui c'est correct

[Igore]

Merci beaucoup !