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[Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

  1. #31
    Toll

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    bonjour, j'aimerai bien joué mais bon je en suis plus en M1 ni M2 .... "au dessus"

    sinon, je suis étonné que personne n'est explicité le principe de cette technique couramment utilisée en analyse bioch dans les labos???


    Citation Envoyé par Vinc
    4)On réalise des expériences de Western-blot en utilisant des anticorps anti Erk total et anti Erk phosphorillé, sur ces 2 lots de cellules.
    Quel est le principe d’un Western blot ? Pourquoi utilise t-on 2 types d’anticorps anti Erk, qu’est ce que cela apporte ?

    -----


  2. Publicité
  3. #32
    Vinc

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Salut!
    Citation Envoyé par Toll
    bonjour, j'aimerai bien joué mais bon je en suis plus en M1 ni M2 .... "au dessus"
    Ben vas y ne te prive pas pour ça, il y a toujours moyen de discutter

    Citation Envoyé par Toll
    sinon, je suis étonné que personne n'est explicité le principe de cette technique couramment utilisée en analyse bioch dans les labos???
    Oui moi aussi je suis assez surpris! C'est quand même le minimum à connaître en bioch/BM/Bio Cell ....
    Primum non nocere.

  4. #33
    vinceb62

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bonjour!

    je suis en P1 donc je pourrais pas répondre à toutes les questions mais j'ai bien envie de tenter ma chance!

    allé c'est parti!

    I°) Les récepteurs tyrosine kinase

    1)Rappeler brièvement la structure d’un récepteur tyrosine kinase. Quelles particularités possède t-il ?

    Alors le recepteur tyrosine kinase (RTK) fait parti de la classe des recepteurs enzymes. c'est un recepteur transmembranaire à une traversée. Il à donc 2 domaines, un exodomaine, site de liaison du signal, et un endodomaine qui possède l'activitée protéine tyrosine kinase c'est à dire phosphorylation du groupe OH de la tyrosine.


    2)Pourquoi la dimérisation des récepteurs est–elle nécessaire pour transduire le signal ? Connaissez vous un type de récepteur tyrosine kinase qui fait exception à cette dimérisation ? Si oui lequelle et pourquoi ?

    La dimérisation permet une phosphorylation croisée, et ainsi activer l'activiter kinase de l'endodomaine. Je ne connais pas de RTK qui ne se dimérise pas...


    3)Citer les 2 types de domaines protéiques succeptibles d’interagir avec ces récepteurs tyrosine-kinase. Citez le nom d’une protéine adaptatrice possédant un de ces 2 domaines et se liant directement au récepteur.

    J'ai peut etre déja répondu... l'exodomaine sur lequel vient se fixer le signal et l'endodomaine avec lequel réagit une protéine Ras (petite protéine G)


    4)Qu’est ce qu’une GEF ? Citez le nom d’une GEF interagissant avec la protéine Ras.

    Alors moi aussi j'aurais pensé comme Sophdebesac pour le EGF qui est en fait un facteur de controle pour la mitose en G1. Donc en fait j'en ai aucune idée!


    II°) Notions générales sur la cancérogenèse

    1)Pourquoi dit-on que le cancer est une maladie de vieillesse ?

    Le cancer est dû à un défaut d'apoptose. donc une mutation dans les gênes codants pour les facteurs de l'apoptose peut-être... mutation qui ont lieux après un certain age car des erreurs ont pu endomager l'ADN (radiation UV par exemple)
    -> je sais pas trop en fait


    2)Rappeler la définition d’un oncogène, d’un suppresseur de tumeur. Il existe une troisième catégorie de gènes succeptible de provoquer des cancers, si les gènes sont mutés. Quelle est cette catégorie et pourquoi peut-elle être impliquée dans la genèse des cancers ?

    Oncogène = gène muté par rapport au gène normal
    Suppresseur de tumeur = ?
    la 3ème catégorie serait-ce les mutagènes?

    3)Définissez les notions d’angiogenèse, de métastase et de micrométastase.

    je sais pas


    III°) Le rôle de Ras dans la cancérogenèse

    là le niveau est trop élevé! je vais juste essayer de répondre à

    4)On réalise des expériences de Western-blot en utilisant des anticorps anti Erk total et anti Erk phosphorillé, sur ces 2 lots de cellules.
    Quel est le principe d’un Western blot ? Pourquoi utilise t-on 2 types d’anticorps anti Erk, qu’est ce que cela apporte ?


    Alors le westernblot est une technique d'étude de protéines qui incubé avec des anti corps radioactifs peuvent réveler la protéine par radiographie.
    l'utilisation de 2 anti corps pourrait servie à mettre en évidence les protéines mutées?



    voila, j'ai fait ce que j'ai pu avec mes connaissances, jpense pas avoir ajouter bcp de nouveautés, mais bon j'avais envie de participer

    voila a bientot
    et merci pour cet exercice

  5. #34
    piwi

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bonjour,

    Quelques remarques quant à vos réponses.
    c'est un recepteur transmembranaire à une traversée. Il à donc 2 domaines, un exodomaine, site de liaison du signal, et un endodomaine
    Plutot que de parler de domaine transmembranaire à une seule traversée dites plutot: un seul domaine transmembranaire.
    Dans le même ordre d'idées, on parle plutot de partie, domaine, fraction, région... intra cellulaire et extracellulaire.
    Je ne connais pas de RTK qui ne se dimérise pas...
    Si le mon vous échappe (mais je suis sur que vous le connaissez), ne voyez vous pas une raison pour laquelle il ne se dimériserait pas?
    l'endodomaine avec lequel réagit une protéine Ras
    RAS n'interagit pas directement avec le récepteur!
    Le cancer est dû à un défaut d'apoptose.
    Beaucoup, beaucoup trop réducteur! L'apoptose est effectivement dérégulée dans le cancer mais c'est un facteur parmis d'autres.
    En premier chef l'oncogenèse est due à une dérégulation du cycle cellulaire. D'autres anomalies surviennent ensuite pour permettre à la croissance de perdurer et de s'installer.
    Alors le westernblot est une technique d'étude de protéines qui incubé avec des anti corps radioactifs peuvent réveler la protéine par radiographie.
    l'utilisation de 2 anti corps pourrait servie à mettre en évidence les protéines mutées?
    C'est court... Quelles sont les grandes étapes de la manip'? Pourquoi un anticorps radioactif?
    Pour la manip' qu'est ce qu'un Erk phosphorylé? Que signifie le fait d'en avoir beaucoup? Pas du tout?

    Aller courage!

    Cordialement,
    piwi

  6. #35
    Vinc

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Salut! Bon Piwi a déjà répondu mais je vais tout de même préciser un peu les réponses que j'attend sans les donner complètement!
    Citation Envoyé par vinceb62
    Alors le recepteur tyrosine kinase (RTK) fait parti de la classe des recepteurs enzymes. c'est un recepteur transmembranaire à une traversée. Il à donc 2 domaines, un exodomaine, site de liaison du signal, et un endodomaine qui possède l'activitée protéine tyrosine kinase c'est à dire phosphorylation du groupe OH de la tyrosine.
    Oui aors comme l'a dit Piwi, on parle plutôt de domaine transmembranaire, de domaines intra ou extra cellulaires.

    Citation Envoyé par vinceb62
    La dimérisation permet une phosphorylation croisée, et ainsi activer l'activiter kinase de l'endodomaine. Je ne connais pas de RTK qui ne se dimérise pas...
    Bon.....il y a une autre caractéristique qui est très importante! Mis à part pour la transphosphorylation, il y a une nescessité structurale à la dimérisation.....sauf pour le récepteur à une hormone particulière. Pour t'aiguiller, cette hormone est ultra connue même par le premier pélerin qui passe dans la rue et elle intervient dans la régulation de la glycémie........j'en ai trop dit!


    Citation Envoyé par vinceb62
    J'ai peut etre déja répondu... l'exodomaine sur lequel vient se fixer le signal et l'endodomaine avec lequel réagit une protéine Ras (petite protéine G)
    Non là en core comme l'a dit Piwi, la prot G n'intérragit pas directement avec le récepteur.... J'ai déjà donné la réponse à cette question...!

    Citation Envoyé par vinceb62
    Alors moi aussi j'aurais pensé comme Sophdebesac pour le EGF qui est en fait un facteur de controle pour la mitose en G1. Donc en fait j'en ai aucune idée!
    Bon alrs là encore j'ai déjà répondu! En ce qui concerne l'EGF (Epidermal Growth Factor), c'est un facteur de croissance qui intervient effectivement en G1 pour permettre la synthèse de la cycline D.


    Citation Envoyé par vinceb62
    Le cancer est dû à un défaut d'apoptose. donc une mutation dans les gênes codants pour les facteurs de l'apoptose peut-être... mutation qui ont lieux après un certain age car des erreurs ont pu endomager l'ADN (radiation UV par exemple)
    -> je sais pas trop en fait
    Piwi a également précisé que cette réponse était très réductrice.... Certes on a un échappement à l'apoptose mais il y a énorméménet d'autres choses qui ne vont pas! On essaira de faire une synthèse de toutes ces modifs à la fin de l'éxo!


    Citation Envoyé par vinceb62
    Oncogène = gène muté par rapport au gène normal
    Suppresseur de tumeur = ?
    la 3ème catégorie serait-ce les mutagènes?
    Là encore j'ai également répondu il me semble mais ce qu'il faut comprendre ici (je réagis par rapport à ta première réponse sur les oncogènes), c'est que les oncogènes ne sont pas forcément mutés et il y a d'autres moyen de mettre le bor...l avec un gène normal! Le but est "d'activer le proto oncogène mais ca ne se fait pas nescessairement par mutation...
    On en parlera plus tad! Sinon, pour commenter un peu ta réponse, un suppresseur de tumeur est globalement l'inverse d'un oncogène. Pour la troisième catégorie, je n'ai pas encore donné la répons emais je vais le faire : ce sont les DNA Damage Response Genes, c'est à dire des gène simpliqués dans la réparation de l'ADN. Car si ces gène ssont mutés, on augmente d'autant plus le risque d'avoir des mutation dans les proto oncogènes ou dans les suppresseurs de tumeur.... donc c'est un rôleindirect mais bien réel!


    Citation Envoyé par vinceb62
    III°) Le rôle de Ras dans la cancérogenèse
    là le niveau est trop élevé!
    En fait tu as répondu à la quetsion sans le savoir ! C'est paradoxal mais tu connais le rôle de Ras sans savoir vraiment ce que c'est ! Tout à l'heure tu as bien dit que l'EGF était un facteur de croissance impliqué dans la prolifération cellulaire. Sais tu ce qui se passe après la fixation de l'EGF sur son récepteur? Sais tu de quel type est le récepteur à l'EGF? Réfléchis y un petit peu et tu vas comprendre!


    Citation Envoyé par vinceb62
    Alors le westernblot est une technique d'étude de protéines qui incubé avec des anti corps radioactifs peuvent réveler la protéine par radiographie.
    l'utilisation de 2 anti corps pourrait servie à mettre en évidence les protéines mutées?
    Oui..... mais comme l'a dit Piwi c'est assez courts. Mia d'un autre côté tu n'es qu'en P1 donc c'est tout à fait normal que tu ne puisses pas répondre précisément à cette question. Néanmoins, réfléchis pour le rôle des 2 anticorps.... Qu'est ce que représente une phosphoryllation?? Qu'est ce que ca veut dire globalement?? Pourquoi veut-on faire la différence entre une protéine phosphoryllée et une protéine non phosphoryllée???



    Citation Envoyé par vinceb62
    voila, j'ai fait ce que j'ai pu avec mes connaissances, jpense pas avoir ajouter bcp de nouveautés, mais bon j'avais envie de participer
    voila a bientot
    et merci pour cet exercice
    Rassure toi c'est pas mal du tout pour un P1 ! Essaye te continuer en tenant compte des remarques de Piwi (et des miennes ) et tu vas voir que le processus global va venir....

    A+ et persévère t'es pas loin!
    Vinc
    Primum non nocere.

  7. #36
    vinceb62

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    merci pour vos réponses constructives je vais retenter ce soir faute de temps pour le moment (concours oblige!) mais j'ai hate! j'aime bien cet exercice

    a bientot!

  8. #37
    bina55

    Question Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Quels sont les différentes parties d'egfr? Je veux l'explication de chaque partie, MERCI.

  9. #38
    Vinc

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Salut!
    Heu.....je ne suis pas sûr d'avoir bien compris ta question... Tu veux connaitre la structure du récepteur à l'EGF c'est ca?
    Bon si c'est ca c'est un récepteur possedant un seul segment transmembranaire avec la partie Nt extracellulaire qui reconnait le ligand, la partie transmembranaire hydrophobe et la partie Ct intracellulaire qui possède l'activité tyrosine kinase. Lorsqu'un ligand se fixe sur ce récepteur, les récepteurs se dimérisent, la partie transmembranaire transmet une déformation structurale ce qui active le domaine intracellulaire (qui possède l'activité tyrosine kinase) et tu as une transphosphoryllation de chaque récepteur par son voisin (car ils sont oragnisés en dimère)...
    Voilà, j'espère avoir répondu à ta question...

    A+ et n'hésite pas à répondre au reste de l'exercice
    Vinc
    Dernière modification par Vinc ; 17/04/2006 à 21h19.
    Primum non nocere.

  10. #39
    bina55

    Arrow Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Merci Mr Vinc, moi je sais tous celà. Mais je veux savoir les trois domaines de la partie intracytoplasmique de l'EGFR avec l'explication et les caractéristiques de chacun. Merci encore.

  11. #40
    Vinc

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Salut!
    Ben fallait le dire !
    Bon alors en intra cellulaire tu as effectivement plusieurs domaines qui sont (de la membrane vers Ct):
    - un domaine riche en serine et thréonine qui s'étend sur environ 50 aa et qui peut-être phosphoryllé par les MAP-Kinase ou la PKC.
    - un domaine tyrosine kinase (d'environ 250 à 350 aa il me semble) qui peut donc lier l'ATP
    - un dernier domaine qui possède les sites d'autophosphoryllation sur les tyrosines, ainsi que des séquence d'endocytose pour le turn-over du récepteur.

    Pour ce qui est des tyrosines phosphoryllées sur le denier domaine je ne les ai plus en tête mais je peux le rechercher si ça te dis...
    En espérant (cette fois ci )avoir répondu à ta question!

    A+
    Vinc
    Dernière modification par Vinc ; 18/04/2006 à 10h59.
    Primum non nocere.

  12. #41
    bina55

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bonjour,
    Pouvez vous me donner une petite définition du terme 'transduction du signal'.
    Merci.

  13. #42
    mantOs

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    La transduction du signal est l'ensemble des processus qui permettent à une cellule de répondre à un stimulus .
    Ce stimulus , messager primaire souvent extracellulaire (facteurs de croissance par exemple), va induire une cascade de messages ( messager secondaire ) intracellulaires .
    Cette cascade fait intervenir plusieurs proteines souvent des enzymes de type kinases (qui phosphorylent) et phosphatase (qui déphosphorylent) .
    En fin de cascade on trouve donc une modulation de l'information génétique.

    J'espere m'etre bien exprimé

  14. #43
    mantOs

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Citation Envoyé par Vinc
    Salut! Bon Piwi a déjà répondu mais je vais tout de même préciser un peu les réponses que j'attend sans les donner complètement!

    Oui aors comme l'a dit Piwi, on parle plutôt de domaine transmembranaire, de domaines intra ou extra cellulaires.


    Bon.....il y a une autre caractéristique qui est très importante! Mis à part pour la transphosphorylation, il y a une nescessité structurale à la dimérisation.....sauf pour le récepteur à une hormone particulière. Pour t'aiguiller, cette hormone est ultra connue même par le premier pélerin qui passe dans la rue et elle intervient dans la régulation de la glycémie........j'en ai trop dit!
    J'ai du mal a voir une autre raison a la dimérisation que celle de la transphosphorylation
    La fixation du ligand est necessaire a la modulation de la configuration du recepteur avec libération du domaine protéique II qui permet la dimérisation.

    Citation Envoyé par Vinc
    Non là en core comme l'a dit Piwi, la prot G n'intérragit pas directement avec le récepteur.... J'ai déjà donné la réponse à cette question...!
    Je récapitule les réponses :
    Le domaine kinase phosphorylé du recepteur permet la fixation de la protéine adaptatrice SH2-Grb2 par interaction entre la Tyr-P du recepteur et Asn de Grb2.
    Ensuite le domaine SH3 de Grb2 va recruter protéine SOS (GEF) qui va interagir avec RAS.
    RAS va etre lié avec RAF qui va phosphoryler protéine MEK. MEK va elle aussi phosphoryler ERK (MAP kinase)
    La forme phosphorylée permet la dimérisation de ERK et sa translocation dans le noyau. Une fois dans le noyau ERK-ERK ( dimere ) va phosphoryler p62 (TCF) et former un hétéro-dimere avec p67 (SRF). Cet hétéro dimere est un facteur de transcription et active entre autre la transcription de C-fos ( impliqué ds proliferation cell ).


    Citation Envoyé par Vinc
    Bon alrs là encore j'ai déjà répondu! En ce qui concerne l'EGF (Epidermal Growth Factor), c'est un facteur de croissance qui intervient effectivement en G1 pour permettre la synthèse de la cycline D.



    Piwi a également précisé que cette réponse était très réductrice.... Certes on a un échappement à l'apoptose mais il y a énorméménet d'autres choses qui ne vont pas! On essaira de faire une synthèse de toutes ces modifs à la fin de l'éxo!
    Une cellule transormée réponds à quelques caractéristiques spécifiques dont un défaut d'apoptose , une indépendance d'ancrage , une absence d'inhibition de contact , et une proliferation intense.
    Citation Envoyé par Vinc
    Là encore j'ai également répondu il me semble mais ce qu'il faut comprendre ici (je réagis par rapport à ta première réponse sur les oncogènes), c'est que les oncogènes ne sont pas forcément mutés et il y a d'autres moyen de mettre le bor...l avec un gène normal! Le but est "d'activer le proto oncogène mais ca ne se fait pas nescessairement par mutation...
    On en parlera plus tad! Sinon, pour commenter un peu ta réponse, un suppresseur de tumeur est globalement l'inverse d'un oncogène. Pour la troisième catégorie, je n'ai pas encore donné la répons emais je vais le faire : ce sont les DNA Damage Response Genes, c'est à dire des gène simpliqués dans la réparation de l'ADN. Car si ces gène ssont mutés, on augmente d'autant plus le risque d'avoir des mutation dans les proto oncogènes ou dans les suppresseurs de tumeur.... donc c'est un rôleindirect mais bien réel!
    Pour la 3eme catégorie , la protéine p53 a un role fondamental dans la réparation des dommages de l'ADN et est mutée dans un bon nombre de cancer.

    Citation Envoyé par Vinc
    En fait tu as répondu à la quetsion sans le savoir ! C'est paradoxal mais tu connais le rôle de Ras sans savoir vraiment ce que c'est ! Tout à l'heure tu as bien dit que l'EGF était un facteur de croissance impliqué dans la prolifération cellulaire. Sais tu ce qui se passe après la fixation de l'EGF sur son récepteur? Sais tu de quel type est le récepteur à l'EGF? Réfléchis y un petit peu et tu vas comprendre!



    Oui..... mais comme l'a dit Piwi c'est assez courts. Mia d'un autre côté tu n'es qu'en P1 donc c'est tout à fait normal que tu ne puisses pas répondre précisément à cette question. Néanmoins, réfléchis pour le rôle des 2 anticorps.... Qu'est ce que représente une phosphoryllation?? Qu'est ce que ca veut dire globalement?? Pourquoi veut-on faire la différence entre une protéine phosphoryllée et une protéine non phosphoryllée???
    La phosphorylation est la fixation d'un phosphate ( venant d'ATP , GTP etc ... ) sur un acide aminé spécifique grace a l'intervention de kinase .
    Le residu sera une tyrosine dans le cas de tyrosine-kinases.

    La fixation de ce phosphate est synonyme de changement conformationnel de la protéine induisant son activation ou inactivation .

    Les 2 sortes d'anticorps sont surement dirigés contre un épitope différent dont un n'est accessible qu'apres la phosphorylation de la protéine ?


    Voila j'ai essayé d'ajouter ma pierre à l'édifice .

  15. #44
    bina55

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    s'il vous plait, pouvez-vous m'envoyer une image qui montre les différentes étapes de voie de MAP kinase. merci

  16. #45
    mantOs

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    en simplifié :





    source www.brc.riken.jp

  17. #46
    bina55

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bonjour, svp j'ai besoin de:
    -Une image animée et une image sans animation qui montrent les étapes de la transduction du signal de GPCR.
    -Une image du récepteur canaux ioniques (activé par un liguand)
    -une image montrant la transduction du signal du récepteur couplé à une tyrosine kinase
    -une image de la transduction du signal du récepteur doué d'activité tyrosine kinase.
    Et merci.

  18. #47
    piwi

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    On peut faire tout ca avec powerpoint.
    Pour l'image animée je crois que photoshop et paint shop pro permettent de creer des gifs animés.

    Cordialement,
    piwi

  19. #48
    KiKiZab2000

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    bojour
    Je voudrais savoir combien de temps (environ)une transduction d'un signal du genre celle qui passe par recepteur,ras she sos, cascade kinase ,trancrition du gene...met de temps.
    Apparament c'est par cette voie que la cellule peut s'adapter l'osmolarité de son milieu.Vue les étapes de la transduction je pense qu'il ne faut pas un changement brutal de son environnement.
    Quelqu'un aurait il un ordre de grandeur concerant cette voie et autres si ça vous dit.(histoire de comparer les différentes voies)

    Merci

  20. #49
    pimd

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bon je me penche sur le probleme du western blot (pour info, je suis en M1 biochimie biotechnologie)

    Tout d'abord on extrait les proteines totales de l'extrait cellulaire.
    On effectue ensuite une electrophorese sur gel d'agarose (non denaturant) qui va permettre de separer les proteines en fonction de leur pm (et de leur pka - electrophorese 2D). On transfere les proteines sur une membrane de nitrocellulose, et on met en presence des anticorp anti-erk et anti-erkP, ces anticorps sont marqués radioactivement pour pouvoir les localiser par autoradiographie (cela dit un marquage par un anticorp secondaire de chaque anticorp primaire, marquée par 2 fluorochrome different permetrait de differencier les spots obtenu tres facilement ).
    on rince, on effectue donc une autoradiographie, et on localise les anticorp, et donc les proteines. (si on a pas foiré la manip...)
    euh, je pense avoir etait complet.. (enfin sans non plus rentrer dans les detail du genre : comment coule t'on un gel ect...)

  21. #50
    pimd

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    verdict ? que des conneries ?

  22. #51
    Vinc

    Re : [Bio] [L2/M1] Transduction du signal et cancérogenèse

    Bon je répond 3 ans apès la bataille......

    Citation Envoyé par pimd Voir le message
    Tout d'abord on extrait les proteines totales de l'extrait cellulaire.
    Mouai...mais qu'est ce que tu appelles "extraction"? En fait on lyse les cellules tout simplement, et c'est ce lysat que l'on va charger sur gel!

    Citation Envoyé par pimd Voir le message
    On effectue ensuite une electrophorese sur gel d'agarose (non denaturant) qui va permettre de separer les proteines en fonction de leur pm (et de leur pka - electrophorese 2D).
    Non non non! On utilisera préférentiellement l'acrylamide pour les protéines et surtout tu te mettras en conditions dénaturantes (SDS, DTT ou béta mercapto, chauffage) pour ne pas être embêté par les complexes! Tu veux suivre P-Erk tout seul qui s'associe à pas mal de protéines vu que c'est une kinase, sans ses partenaires.


    Citation Envoyé par pimd Voir le message
    On transfere les proteines sur une membrane de nitrocellulose, et on met en presence des anticorp anti-erk et anti-erkP,
    Oui mais pas en même temps vu que les 2 formes ont le même poids moléculaire! Classiquement je commence par P-Erk avec processus complet (ECL), ensuite stripping puis Erk total.


    Citation Envoyé par pimd Voir le message
    ces anticorps sont marqués radioactivement pour pouvoir les localiser par autoradiographie (cela dit un marquage par un anticorp secondaire de chaque anticorp primaire, marquée par 2 fluorochrome different permetrait de differencier les spots obtenu tres facilement ).
    on rince, on effectue donc une autoradiographie, et on localise les anticorp, et donc les proteines. (si on a pas foiré la manip...)
    Pourquoi faire simple quand on peut faire compliqué???
    Non c'est bien moins compliqué! Si il fallait travailler avec de la radioac chaque fois que l'on fait un western on s'ensortirait pas!
    Tu as un primaire d'espèce connu (souvent mouse, goat ou rabbit) et un secondaire marqué HRP (péroxydase) qui reconnait le Fc spécifique de l'espèce du primaire!
    Ex: tu met un anti P-Erk mouse, ensuite tu fais te slavages classiques, tu mets ton secondaire anti mouse.
    En fait la péroxydase permet former des radicaux libres à partir de l'H2O2 (un des réactifs ECL utilisé). Les radicaux libres permettent la transformation du luminol (l'autre réactif ECL) en luminol activé qui émet des photons lors de sa désactivation et ce sont ce sphotons qui vont venir impressioner le film d'autoradiographie que tu places en contact avec ta membrane....

    Pas question de fluorophore ici!


    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

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